探究宿主-病原體相互作用的特點是研究微生物與免疫學(xué)方向?qū)W科的重要方法。宿主細胞吞噬病原體后其表征將會改變。利用實時PCR儀或者ELISA的技術(shù)，測量與基因編碼蛋白相關(guān)的行為是消除病原體還是免疫逃逸。多數(shù)研究都利用主要宿主細胞或者細胞系在體外實現(xiàn)。該方法得到的數(shù)據(jù)能夠說明RNA的表達或細胞培養(yǎng)中回收的蛋白質(zhì)的量。在實驗條件下，所有的宿主細胞擁有相同數(shù)量病原體具有合理性。然而，利用吞噬細胞的病原體吸收是不同步的。所以，包含了不同數(shù)量病原體的宿主細胞導(dǎo)致不同致病菌誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)生物合成。因此，我們構(gòu)建了一項技術(shù)應(yīng)用免疫熒光高通量分析方法用來檢測與宿主細胞相關(guān)的病原體的數(shù)量。結(jié)合多色分子染色，使分析宿主細胞種群的感染情況和寄生負荷的結(jié)果（相關(guān)宿主細胞的表型）變成可能。

寄生蟲與宿主細胞的聯(lián)系是微生物學(xué)和免疫學(xué)其中重要的一部分。隨著單克隆抗體和熒光標記試劑應(yīng)用的產(chǎn)生，關(guān)于宿主細胞在進程中的變異研究越來越多。

事實上，科研中已經(jīng)存在利用多通道流式細胞分析術(shù)和熒光顯微技術(shù)方法來檢測寄生蟲與宿主細胞關(guān)系。以上兩種方法都具有優(yōu)缺點。流式細胞分析術(shù)（FACS）能夠檢測擁有寄生蟲的宿主細胞的表型，但是不能精確到單細胞中寄生蟲的數(shù)量。而且，流式細胞分析需要單細胞制備所以不能做到細胞原位的定位。雖然熒光顯微技術(shù)的準確性更高，擁有寄生蟲的宿主細胞可以說明原位表面marker的表達情況。但是，做到宿主細胞寄生負荷marker強度的高度客觀仍然存在困難。因此，一種能夠?qū)�單細胞定量和宿主細胞表型分析相結(jié)合的技術(shù)是十分必要的。

實驗的分析部分，我們利用了奧地利TissueGnostics公司的TissueQuest和StrataQuest軟件，此軟件能夠同時滿足單細胞定量分析和宿主細胞表型分析。以Dot-Finder專利運算法為核心的新型高通量多色顯微成像技術(shù)，分析感染了L.major的原位及體外巨噬細胞。該方法做到了對擁有病原體的成核細胞的全面分析。與流式細胞術(shù)（FACS）相比，熒光標記marker的強度能夠在原位單細胞級別定量且不需要制備細胞懸浮液。另外，TissueQuest軟件能夠?qū)崿F(xiàn)從實驗數(shù)據(jù)精確反向回溯到影像中的細胞。反向回溯的特征可以用來檢測原位細胞亞群，設(shè)門細胞的定位信息。同樣，此項功能可以作為最終的結(jié)果構(gòu)象。

本實驗中應(yīng)用三種marker：DAPI為核染色marker，AF546（CD11b）和Cy5(F4/80)為另兩種。
通過調(diào)節(jié)如下簡單參數(shù)完成軟件分析：
a. 核的尺寸
b. 面積
c. 灰度值
應(yīng)用反向回溯特點實時觀察創(chuàng)建的陽性細胞散點圖。根據(jù)細胞尺寸和染色強度確定cut-off值。檢測DAPI的陽性值和細胞中活性L.major，利用ring mask功能創(chuàng)建DAPI通道。

淋巴腺體部分的胞內(nèi)病原體檢測

上圖中為TissueQuest軟件的細胞核檢測和ring mask計算功能。灰階圖影像利用StrataQuest軟件進行分析。單通道灰階影像利用TissueQuest軟件進行分析。
（A）通過參數(shù)調(diào)節(jié)進行核檢測（B）創(chuàng)建ring mask (C)ring mask中黃色高亮
部分為自動篩選ROI中病原體。

TissueFAXSi-plus設(shè)備完成了影像的掃描部分

利用此設(shè)備做到單通道影像獲取，利用四通道進行熒光檢測（DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5）。每個影像包含將近50-200個細胞，并且TissueFAXS能做到自動拼接。利用TissueQuest軟件的參數(shù)進行核檢測。每個熒光通道的影像和多個FOV都能夠被自動獲取，收集和后期的組合。

TissueQuest檢測各種ring mask中的L.major病原體

根據(jù)活性病原體的微弱DAPI信號和復(fù)雜的背景信息，新型的運算法需要從中識別病原體。每種獨立的運算法不可能同時滿足所有的實驗需要。Parasite finder預(yù)設(shè)程序可根據(jù)用戶需要選擇方法最高程度的區(qū)別背景與待分析部分。（A）ring mask圈出胞質(zhì)部分，代表缺少病原體培養(yǎng)的條件下的巨噬細胞。（B）藍色部分為感染的巨噬細胞的ring mask,黃色箭頭標出DAPI的陽性信號。（C）舉例說明的運算法用來檢測微弱信號區(qū)別沒有被感染的巨噬細胞的ring mask中的偽信號。（黃色部分）（D）創(chuàng)建偽陽性信號。多于30個病原體的巨噬細胞被藍色標出。（E）檢測微弱信號區(qū)分沒有被感染的巨噬細胞的ring mask中的非偽信號。（F）所有被感染的巨噬細胞（黃色部分和黃色箭頭）均被識別出。

TissueQuest定量分析感染的巨噬細胞病原體密度和感染比例

（A）軟件自動計算感染與未感染的巨噬細胞。（B）每個巨噬細胞胞內(nèi)寄生蟲的平均數(shù)量的定量分析。在分析了237個與8639個細胞后，得出隨即選擇的樣本足以證明總感染比例的正確性。（C）胞內(nèi)寄生蟲與巨噬細胞的關(guān)系。胞內(nèi)病原體的數(shù)量和Y軸相應(yīng)的病原體對應(yīng)的巨噬細胞擁有病原體的數(shù)量區(qū)間。

此圖闡明巨噬細胞中的活病原體的高度混雜性。推測原因為多樣化的吞噬作用和病原體繁殖的加強。巨噬細胞的表型決定胞內(nèi)病原體擴張存在可能性。

利用感染與未感染的原位巨噬細胞定量分析骨髓細胞marker的表達

TissueQuest軟件根據(jù)胞內(nèi)病原體，估算每個成核原位宿主細胞。通過擁有不同數(shù)量病原體的巨噬細胞，比較不同marker的表達。
擁有不同寄生蟲數(shù)量的巨噬細胞的表型分析。
(A)直方圖表示X軸巨噬細胞擁有病原體與Y軸病原體的數(shù)量。TissueQuest軟件得到細胞核，ring mask，ring mask中的病原體，ring mask中的CD11b或者F4/80的強度表達（B）擁有不同數(shù)量病原體的巨噬細胞的平均強度分析。

體外原位成活與失活胞內(nèi)病原體的診斷

此圖為體外活細胞和死細胞的定量分析。因為失活病原體不能夠吸收DAPI，所以軟件能夠做出宿主細胞中病原體的區(qū)別。對樣本進行EB-AO平行染色。StrataQuest識別細胞的胞質(zhì)（綠色部分），細胞與細胞接觸部分（橘色）。

（A）AO灰階圖用于薄膜的檢測（綠色部分），細胞邊緣的確定（橘色部分）。（B）對粘連細胞進行詳細分析。（C）反向回溯確定巨噬細胞擁有多于2個失活寄生蟲。（E）擁有失活寄生蟲的巨噬細胞的頻率分析。（F）擁有不同數(shù)量失活寄生蟲的吞噬細胞的頻率分析。

冰凍切片利用DAPI染色然后TissueQuest進行分析。DAPI的信號指出病原體的DNA并未退化�；顧z，活檢，干燥前的病原體仍然具有活性。StrataQuest軟件創(chuàng)建胞核（橘色）和核膜（綠色）。因此，DAPI陽性病原能夠在宿主細胞的胞漿部分進行識別。

此圖為寄生負載的評估。（A）被感染的淋巴腺�；译A圖為DAPI+宿主細胞核和寄生蟲DNA。（B）胞核，胞漿和寄生蟲的重疊影像（C）（D）反向回溯擁有3和5-10寄生蟲的細胞（E）感染細胞的寄生負載。
此實驗中，TissueQuest和StrataQuest軟件能夠檢測如下特點：
1) 寄生負擔(dān)
2) 感染細胞的表型
3) 定位
4) 細胞-細胞聯(lián)系

后續(xù)研究中會著重在宿主-寄生蟲的聯(lián)系的分子反應(yīng)機理，在微生物方向疾病治愈做出提高。