生物制品中殘留DNA檢測標準的變化

2015年3月底，中國食品藥品檢定研究院網(wǎng)站的國家藥品標準物質目錄中新增加了一個編號為410001的產品：CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）。這個由中檢院與中科院聯(lián)合研發(fā)，由生物制藥企業(yè)參與標定的試劑盒與現(xiàn)行美國藥典（USP）建議的檢測方法同步，但與2010版藥典附錄中外源性 DNA 殘留量測定法有所不同，可能會對國內生物制品的研發(fā)和生產的上下游企業(yè)產生影響。

生物制品中宿主細胞殘留DNA具有潛在致瘤和傳染風險，所以各國藥品監(jiān)管部門對DNA雜質的限量要求非常嚴格。美國藥典在General Chapter <1130>介紹了三種常用技術，但將在2015年頒布的新版（USP38–NF33）中增加全新章節(jié)（General Chapter <30>）來進一步規(guī)范殘留DNA檢測的方法和標準物質。與1000號以上的章節(jié)不同的是，USP編號1000以內的章節(jié)詳細規(guī)定了檢測技術、系統(tǒng)適應性標準和標準物質。新版USP中將唯一推薦qPCR法作為生物制品中宿主殘留DNA的標準方法。qPCR法的技術優(yōu)勢在于序列特異性高、靈敏度高、重現(xiàn)性好、人為干擾因素少，可以為生物制藥工業(yè)在工藝研究和成品質量控制方面提供可靠的檢測手段。

我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開始就對生物制品中殘余DNA含量進行限制。從衛(wèi)生部頒布的《人用重組DNA制品質量控制要點》到近年的《中國生物制品規(guī)程》都對DNA含量做了嚴格要求，部分標準高于國際標準。2010年版中國藥典附錄收錄了DAN探針雜交法和熒光染料法，這兩種方法都存在技術缺陷，很難達到雜質限量檢測的靈敏度，已經被歐美藥典摒棄。目前，仍有很多國內企業(yè)沿用這兩種方法檢測殘留DNA，致使生產工藝和產品質量很難達到國際一流水平。根據(jù)殘余DNA檢測技術的發(fā)展趨勢，小編預計我國2015版藥典或增補版本中將出現(xiàn)qPCR方法。企業(yè)在生產與研發(fā)中采用中檢院標準物質目錄中提供的試劑盒，可以大幅度減少費時、耗力、成本高昂的方法學考察，只需開展少量方法適應性實驗，就可以在生產工藝和質控體系的優(yōu)化方面發(fā)揮實際作用，同時滿足美國FDA相關標準的要求。同時，試劑盒聯(lián)合研發(fā)單位中科院湖州營養(yǎng)中心提供免費技術咨詢和培訓，幫助企業(yè)解決應用中的各種技術問題。

生物制品可用于治療和預防疾病，關系到患者和健康人的用藥安全，產品質量必須得到保障。我國藥品監(jiān)管部門對生物制品中殘留DNA的限量標準制訂的非常嚴格，但藥典修訂存在一定滯后性，附錄中的檢測技術與先進國家尚存在差距，企業(yè)在研發(fā)和生產中應具有一定前瞻性，否則會使改進工藝、提高質量、保障安全的努力大打折扣。

為什么要檢測殘余DNA？

生物制劑是制藥行業(yè)中發(fā)展最快的領域，2014年全球十大暢銷藥中7個是生物制劑。這些銷售上的重磅炸彈在臨床上療效確切，但研發(fā)成本高，生產和質量控制要求非常嚴格。絕大部分生物制劑是不經過胃腸道直接進入體內，所以除了生物活性外，監(jiān)管部門對藥品中雜質的限量要求非常嚴格。其中，宿主細胞殘留DNA因為具有特別的潛在安全風險，一直是國內外藥品監(jiān)管機構關注的重點。美國藥典會從2011年開始就組織專門小組討論修訂生物制品中殘留DNA檢測方法，并在2014年Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5上宣布將在2015年藥典修訂版中增加新的章節(jié)（General Chapter <30>）來規(guī)范檢測方法和標準物質。為什么美國藥典會的專家組花幾年時間討論一個微量成分（<100pg/劑量）的檢測方法？還要專門增加章節(jié)來規(guī)范化？回答這些問題，先要了解它的來源和潛在危害性。生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產品是用連續(xù)傳代的動物細胞株表達生產，雖然經過嚴格的純化工藝，但產品中仍有可能殘余宿主細胞的DNA片段。這些殘余DNA的片段大小和組成不定，而且潛在的風險也不定，可能帶來傳染性，或致瘤性，或免疫源性增加，或致突變等風險。比如殘留DNA可能攜帶HIV病毒或Ras癌基因；分布在哺乳動物細胞基因組的LINE-1序列可能發(fā)揮逆轉錄轉座子作用插入到染色體中，這種插入可能影響關鍵基因功能的發(fā)揮，比如激活癌基因或抑制抑癌基因；此外，由于微生物來源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重組蛋白藥物在體內的免疫源性風險。目前的研究結果顯示，殘留DNA的致瘤性相比傳染性風險要低，但考慮到致瘤性實驗是動物實驗，傳染性實驗是在細胞水平做的，或許對兩方面的風險都不能掉以輕心。眾所周知，外源蛋白可能引起嚴重免疫反應，但關于殘留DNA誘導的免疫反應的研究還不多。在一些臨床前和臨床研究中報道了高劑量的核酸樣品，比如DNA疫苗或佐劑中的CpG寡聚核苷酸，可以誘導免疫反應，還誘導產生DNA抗體。

生物制品中宿主殘余DNA既是生產中帶來的雜質，還存在一定安全隱患。因此，WHO和各國藥物注冊監(jiān)管機構一般只允許生物制劑中存在100pg/劑量以下的殘留DNA，且鼓勵盡量降低殘余DNA的量和片段長度（小于一個功能基因的長度，按照目前的證據(jù)，大約為200bp）。根據(jù)雜質來源和工藝，特殊情況下最高允許10ng/劑量。

各種殘余核酸檢測技術的優(yōu)劣

正如前面講過，2015年版的美國藥典將新增章節(jié)對殘余DNA檢測進行規(guī)范化，那究竟和現(xiàn)有方法有什么不同？為什么最后只確定了一種方法？我們來看看現(xiàn)行美國藥典對于殘余DNA檢測的總體要求[General Chapter〈1130〉 NUCLEIC ACID-BASED TECHNIQUES—APPROACHES FOR DETECTING TRACE NUCLEIC ACIDS (RESIDUAL DNA TESTING)]。“因為殘留DNA涉及到潛在來源（傳染性病毒DNA）、管理規(guī)程等關鍵問題，藥品監(jiān)管部門建議必須建立產品的DNA殘留檢測方法。不論是否成品的常規(guī)檢測包含DNA殘留含量檢測，還是工藝開發(fā)中已經證實了DNA清除率，殘留DNA技術指標和定量分析監(jiān)測規(guī)程都必須確立。分析方法包括雜交法、基于DNA結合蛋白的免疫色譜法（閥值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA擴增方法。理想的定量檢測方法的靈敏度應該能夠檢測到約10pg/劑量的殘留DNA。雜交法、閥值法和定量PCR方法因為靈敏度可以達到檢測要求，所以屬于經典方法。”下面我們引用美國藥典（USP）<1130>的內容分別介紹一下這三種方法。

雜交法（Hybridization-based）：在這種方法中，根據(jù)宿主DNA序列設計DNA探針用于測定產品中配對DNA的數(shù)量。雙鏈DNA被變性成單鏈后固定在尼龍膜或硝化纖維膜上，DNA探針被隨機摻入標記以后，與膜上固定的樣品宿主DNA雜交結合，并在膠片或成像儀對應位置中顯現(xiàn)斑點。對于熒光標記的探針，斑點的光密度結果可以在儀器中定量分析。斑點光密度對應結合在目標DNA上的探針數(shù)，進而推測出殘留DNA的數(shù)量。通過目測方法可以半定量地檢測樣品中殘留DNA，儀器讀片可以對應斑點光密度繪制標準曲線，對應檢測結果更加準確。

DNA結合蛋白免疫閾值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：這種方法使用DNA結合蛋白和DNA抗體，分四步檢測。第一步，通過加熱把DNA變性成單鏈DNA，變性后DNA與偶聯(lián)了親和素的DNA結合蛋白以及偶聯(lián)了尿素酶的DNA單克隆抗體混合反應，液相中的單鏈DNA、DNA結合蛋白、DNA抗體共同形成序列非特異的復合物。第二步，樣品混合液通過生物素標記的膜，親和素-生物素結合把DNA復合物固定在膜上，洗去非特異吸附。第三步，膜放入檢測儀器中與尿素溶液反應，反應產物氨改變溶液pH值并被儀器記錄變化。這種pH值的變化直接與樣品中的DNA數(shù)目相關。第四步，儀器軟件自動分析原始數(shù)據(jù)確定樣品中殘留DNA數(shù)量。

定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特點已經被應用于生物制藥的一些領域（拷貝數(shù)檢測與病毒檢測）。這項技術能夠確定各種樣品中目標DNA序列的準確數(shù)量。DNA探針的設計非常關鍵，這種DNA探針包含一端染料分子和另一端淬滅分子。當特殊設計的DNA引物引導DNA聚合酶沿著模板序列復制合成另一條對應序列時，DNA聚合酶切斷結合在目標DNA上的探針染料端，釋放到反應液里的染料信號被儀器測量。經過數(shù)十個循環(huán)的DNA擴增，熒光信號與起始DNA模板成對應關系，對應標準曲線可以準確計算出樣品中殘留DNA的數(shù)量。

美國藥典附錄進一步對三種方法進行了應用評價。雜交法可以序列特異性地檢測目標DNA，但³²P標記的探針因為存在半衰期短、放射等問題，實際應用并不廣泛。熒光標記的探針如果采用儀器讀取信號，雜交法理論上可以達到定量檢測要求的靈敏度，但是檢測時間需要48小時。閾值法因為是采用DNA抗體的非特異序列免疫檢測技術，不能特異性識別宿主殘留DNA序列，且容易受到環(huán)境和操作人員的DNA污染，導致讀值偏高。qPCR法具有序列特異性，靈敏度、準確度、精密度都好，還可以高通量篩選，但開發(fā)一個合格的q-PCR試劑檢測宿主殘留DNA并不是件容易的事情。有人會提出疑問，終產品中應該限定任何物種的DNA殘余以確保安全性，所以閾值法是不是最合理的分析方法？這里還需要強調一下宿主殘余DNA檢測的目的：1.確認純化工藝合理，能有效去除宿主DNA殘余；2.確認產品中雜質含量符合標準要求。非特異性的DNA檢測結果不能區(qū)分究竟是生產中污染、檢測污染、或是工藝缺陷引起的DNA殘余，就無法為解決方案提供有效信息。在嚴格的生產體系中，殘留DNA檢測是解決工藝合理性問題，任何外源污染問題都歸SOP或GMP管理體系解決。最后，經典的殘留DNA檢測方法靈敏度不同，qPCR法、DNA結合法、雜交法的檢測限分別達到<1、3、6pg/樣品的水平（目前qPCR法靈敏度可達10fg/反應），但是技術上限制，要求待測DNA片段分別不能小于50、150、600bp才能用于雜交法、q-PCR法、閾值法檢測，而WHO和FDA可接受的DNA 限度內的片段長度<200bp。由此可見，這三種方法中，qPCR法的適用性和技術指標最好。從qPCR技術原理來看，Taqman法要優(yōu)于熒光染料隨機摻入的SYBR Green法。正如前面介紹的USP修訂內容，經過幾年來對三種檢測方法的系統(tǒng)研究和應用反饋，美國藥典會將在新版藥典中唯一推薦qPCR法作為生物制品殘留DNA檢測的標準方法。

我國生物制品中殘余DNA檢測標準與技術

我國參照WHO、FDA和歐盟的標準，很早以前開始就對生物制品中殘余DNA的含量進行限制。酵母、大腸桿菌表達的生物制品限定不超過10ng/劑，CHO和vero細胞表達的EPO、狂犬疫苗、乙肝疫苗等不超過100或10pg/劑。2010年版中國藥典附錄收錄了DNA 探針雜交法和熒光染料法作為殘余DNA檢測方法。以地高辛標記斑點雜交法為代表的DNA雜交法因為操作復雜，耗時較長，且只能半定量，在2014年美國藥典修訂版征詢意見稿中（ PF40(2)）中已經被剔除。以PicoGreen為代表的熒光染料法是基于熒光染料分子直接與雙鏈DNA結合后,經帶有熒光檢測功能的酶標儀激發(fā)后產生熒光信號，因為不能檢出單鏈DNA，且沒有序列特異性，以及靈敏度較低（>300pg）等原因，早已被歐美藥典摒棄。

我國2010版藥典及2015版藥典（附錄IX B 外源性 DNA 殘留量測定法）的征求意見稿中收載了的DNA探針雜交法和熒光染料法，而2009年美國USP就收錄了雜交法、閾值法和qPCR法，到2015年底USP將只收錄高靈敏度、高特異性的qPCR法作為殘留DNA檢測的推薦方法。由此可見qPCR法將成為國際公認的殘留DNA檢測方法，也可能會是我國下一版藥典的主要修訂內容。國內生物制品研發(fā)與生產企業(yè)，以及生產純化填料的上下游企業(yè)，盡早建立以qPCR方法為基礎的宿主殘余DNA檢測體系，將有利于改進工藝、提高產品質量，實現(xiàn)與歐美發(fā)達國家生物藥品標準的接軌。

國家標準物質庫中的試劑盒技術性能

為了提升國內企業(yè)和監(jiān)管部門對生物制品中宿主殘余DNA的檢測技術水平，實現(xiàn)與國際標準的接軌，中檢院聯(lián)合中科院、生產與研發(fā)企業(yè)開發(fā)了首個基于qPCR技術，具有自主知識產權的國產CHO宿主細胞DNA殘留檢測試劑盒。研發(fā)中除了常規(guī)方法學研究和穩(wěn)定性考察，還開展了DNA碎片化、種屬特異性、不同儀器的通用性、高蛋白、低pH、高鹽、國外同類產品性能對比等研究，并在驗證試驗中考察了對國內多家生產企業(yè)和研發(fā)企業(yè)不同樣本基質的適用性。由中檢院采用國家標準物質CHO細胞DNA標定并驗證的試劑盒提供了從樣品提取、純化到PCR檢測的整套試劑，檢測限達到10fg/rxn，抗人、大鼠、小鼠等基因組干擾，內標加樣回收率在70~130%（新版美國USP的標準將調整為50~150%），可以為CHO細胞表達的不同品種、不同劑量的生物制劑提供靈活、準確的DNA限量檢測。試劑盒具有2年保質期，并由聯(lián)合研發(fā)單位中科院湖州營養(yǎng)中心提供免費技術咨詢、操作培訓和方法學驗證服務，幫助企業(yè)盡快掌握該技術。中檢院和中科院湖州營養(yǎng)中心的聯(lián)合研發(fā)項目還將陸續(xù)推出E.coli、Yeast和vero細胞殘余DNA檢測試劑盒，為國內生物制藥產業(yè)的發(fā)展、為監(jiān)管部門制訂國家標準提供技術支持。