實驗原理

通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。

在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。

另外，還有研究證明含有啟動子區(qū)的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默.

實驗試劑

RNase III、 DNA Oligo、Taq酶、dNTP、氯化鈣、磷酸緩沖液、克隆所需試劑、 siRNA合成試劑盒等

實驗步驟

(一)siRNA的設計

1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網(wǎng)站進行目標序列的篩選：

http://www./business/products/order2.htm

http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

http://www.ic.sunysb.edu/Stu/shilin/rnai.html

http://design.dharmacon.com/rnadesign/default.aspx?SID=45358710

2. RNAi目標序列的選取原則：

(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。

Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區(qū)域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。

(2)將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）

(3)選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

3.陰性對照

一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性。

4.目前已證實的siRNA可以在下面的網(wǎng)頁找到：

http://design.dharmacon.com/catalog/category.aspx?key=49

http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_502.html

http://web.mit.edu/mmcmanus/www/siRNADB.html

http://python.penguindreams.net/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published

(二)siRNA的制備

目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經(jīng)RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。

體外制備

1.化學合成

許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究。不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素

2.體外轉錄

以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉染的siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。

3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因�，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型

不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療體內表達前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。

4. siRNA表達載體

多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。

病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩(wěn)定。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。

5. siRNA表達框架

siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。

這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結果不理想。最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了）

(三)siRNA的轉染

將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法：

將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優(yōu)條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉染的失敗。

注意事項

為了達到高的轉染效率，在轉染實驗過程中，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結合，洗脫或通過15-20%膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的細胞培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉染的重復性

通常，健康的細胞轉染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉染細胞，否則細胞轉染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用抗生素

Ambion公司推薦從細胞種植到轉染后72小時期間避免使用抗生素�？股�素會在穿透的細胞中積累毒素。有些細胞和轉染試劑在siRNA轉染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到最佳轉染效果。

5.選擇合適的轉染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞類型的不同，選擇好的轉染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉染和檢測條件

對大多數(shù)細胞，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉入靶細胞（同樣適合實驗靶siRNA），轉染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉染細胞的降低水平。過多的siRNA將導致細胞毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉染過程中導入了siRNA的細胞，將轉染與靶蛋白表達的下調結合起來。