報告基因(reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因,其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定。把它的編碼序列和基因調(diào)節(jié)序列相融合,在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá),從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控。
作為報告基因必須具備的條件:
(1)全序列已測定
(2)表達(dá)產(chǎn)物在手提細(xì)胞中不存在,即無背景,在被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中無相似的內(nèi)源性表達(dá)產(chǎn)物
(3)其表達(dá)產(chǎn)物能夠進(jìn)行定量測定
報告基因的種類很多,根據(jù)對其表達(dá)產(chǎn)物的分析檢測方法的不同,可將其分為體外報告基因和體內(nèi)報告基因。前者的分析需要在含有報告分子的細(xì)胞裂解液或細(xì)胞、組織培養(yǎng)液(分泌型報告基因)中進(jìn)行報告分子的定量。較典型的有氯霉素乙;D(zhuǎn)移酶基因(CAT)、人生長激素基因(hGH)及分泌型堿性磷酸酶基因(SEAP)等。后者的分析可以在活的細(xì)胞或組織中,或在已經(jīng)組化固定的組織或細(xì)胞中進(jìn)行。較典型的如綠色熒光蛋白基因(GFP)。而β-半乳糖苷酶基因(β-Gal)和螢火蟲熒光素酶基因既可以在體外分析也可以在體內(nèi)分析。
常用的報告基因系統(tǒng):
√ 半乳糖苷酶報告系統(tǒng)
√ 熒光素酶報告系統(tǒng)
√ 熒光蛋白報告系統(tǒng):
綠色熒光蛋白(GFP):
可溶性蛋白,性質(zhì)穩(wěn)定;
熒光基團(tuán)相當(dāng)明亮;
熒光在活細(xì)胞中即可觀察,不需要固定和組織加工;
GFP基團(tuán)和目的基因做成融合蛋白后,可以通過轉(zhuǎn)染的方法在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá);
表達(dá)GFP融合物的細(xì)胞能夠在生活狀態(tài)進(jìn)行實驗和檢測。
報告基因 |
優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 (CAT) |
在哺乳動物中沒有內(nèi)源性活性;可用自動化的ELISA方法檢測 |
線性范圍窄;靈敏度相對較低;需要使用放射性同位素 |
β-半乳糖苷酶基因(β-Gal) |
蛋白穩(wěn)定;生物或化學(xué)發(fā)光檢測靈敏;不需要使用同位素 |
在哺乳動物細(xì)胞中有內(nèi)源性活性 |
人生長激素基因(hGH) |
屬于分泌型報告蛋白;操作簡便 |
靈敏度相對較低;線性范圍較窄 |
分泌型堿性磷酸酶基因(SEAP) |
化學(xué)發(fā)光檢測法非常靈敏;線性范圍較寬;價格便宜 |
在某些細(xì)胞中具有內(nèi)源性表達(dá);與篩選的化合物相互干擾 |
熒光素酶基因(Luciferase) |
靈敏性好;線性范圍寬;沒有內(nèi)源性表達(dá);測定方法簡便 |
蛋白的半衰期較短;常規(guī)分析重復(fù)性差 |
綠色熒光蛋白基因(GFP) |
自發(fā)熒光(不需要底物);沒有內(nèi)源性表達(dá);有多種突變體可應(yīng)用 |
需要翻譯后加工;敏感性較低(沒有信號的放大) |