熒光素酶檢測系統(tǒng)，可用裂解液來溫和而快速地提取真核細胞中的熒光素酶，用其底物來檢測熒光素酶活性。檢測步驟如下：

1. 加裂解緩沖液裂解轉(zhuǎn)染的細胞。

2. 將上述裂解物轉(zhuǎn)移入微孔板或者試管中（根據(jù)檢測的需要選擇所用器材類型）。

3. 加入含有所有酶反應(yīng)成分（必須包括底物熒光素），使化學(xué)發(fā)光反應(yīng)開始。

4. 使用熒光儀或者液閃計數(shù)儀檢測所發(fā)射的熒光。

實驗步驟：

注：該操作流程通常用來檢測轉(zhuǎn)染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性，不適用于對細菌熒光素酶進行檢測。

1．實驗第一天，消化并接種細胞（根據(jù)具體實驗選擇合適的細胞）于35mm細胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

2．等細胞密度達到70％時用Luciferase報告基因質(zhì)粒、LacZ的表達質(zhì)粒及其它質(zhì)粒（根據(jù)具體實驗確定）共轉(zhuǎn)染細胞（根據(jù)具體實驗選擇轉(zhuǎn)染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。

3．轉(zhuǎn)染24－36h后，吸去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS（無鈣和鎂離子）洗滌細胞。

注：熒光酶的酶促反應(yīng)會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的細胞在收集細胞前應(yīng)充分洗滌除去含鈣介質(zhì)。

4．在每個培養(yǎng)皿中加入350μl預(yù)冷的harvest buffer,于4 ℃或冰上放置10min裂解細胞。

5．在細胞裂解期間，準備足量的1.5 ml微量離心管，將ATP buffer 與luciferin buffer 以1：3.6比例混合成反應(yīng)液后分裝，每管100μl。

6．依次取等體積的細胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。

注：發(fā)光反應(yīng)會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應(yīng)液后5s內(nèi)必須讀取吸光值。

7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。

8．取剩余裂解液測定LacZ的活性，其讀數(shù)作為內(nèi)標(biāo)用以矯正熒光素酶的讀數(shù)。

9. 用矯正后的讀數(shù)作圖，分析數(shù)據(jù)。

注：熒光素見光易氧化，已稀釋未用的熒光素應(yīng)丟棄。

注意事項：

1.熒光素酶檢測試劑需在15-25℃條件下預(yù)平衡后再進行反應(yīng)，而后依據(jù)具體條件進行自動或手動檢測。當(dāng)用液閃計數(shù)儀時，加入熒光素酶檢測試劑后立即輕輕混勻。

2.如果細胞裂解后不能立即對提取物進行檢測，樣品可以在冰上保存大約5h，在-70℃可保存數(shù)月。不要反復(fù)凍融以避免酶活性的降低。

3.利用上述方法檢測冷的樣品時，其信號強度將下降5-15%。

4.在熒光素酶活性較高的情況下，導(dǎo)致信號超出線性范圍（信號溢出）可用裂解液將樣品進行稀釋。

5.不要儲存稀釋過的樣品。如果必須保存，要在稀釋的樣品中加入BSA至終濃度為2.5mg/ml，這樣可以保持樣品的穩(wěn)定性。

6.一些熒光儀在進行檢測前需要1-2s的穩(wěn)定，因此建議在開機后過一段時間再進行檢測操作。