分子生物學(xué)相關(guān)實驗步驟及注意事項(一)
剛進實驗室的小伙伴們,當(dāng)你們在進行RNA的提取,RT-PCR和QPCR實驗時,是否會有這樣的感受,明明是按照實驗步驟往下做的,實驗結(jié)果卻不如人意,甚至很糟糕呢?小編我也曾經(jīng)被實驗狠狠地虐過呢~為了減少實驗對親們的打擊,在此獻上自己在實驗過程中的一些小經(jīng)驗,希望能幫助到各位小伙伴們~
(一)RNA提取篇
在RNA提取過程中,嚴(yán)格防止RNA酶的污染,并設(shè)法抑制其活性,這是本實驗成功的關(guān)鍵。對于人、動植物組織、細(xì)菌、細(xì)胞等多種RNA的提取,Trizol法效果良好,可同時分離一個樣品內(nèi)的RNA/DNA/蛋白質(zhì)。Trizol裂解細(xì)胞,溶解細(xì)胞內(nèi)含物,同時因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。
如果對RNA純度要求極高或者樣品難以提取,也可以選擇使用RNA提取試劑盒。有同學(xué)用過國內(nèi)的天根,效果還好。小編曾用過Omega的RNA提取試劑盒,效果也挺好的,Promega的總RNA提取試劑盒對多種樣本的小量純化提取效果也還不錯。
動植物總RNA提取——Trizol法的具體步驟如下:
1、將組織物研磨后,取50-100mg加入至1mlTrizol中,充分混合裂解。樣品總體積最好不要超過所用Trizol體積的10%。
2、研磨液室溫靜置5-10min后,加入200μl氯仿,蓋緊EP管,置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩15s。然后冰上靜置10min。
3、于4℃,10000g離心15min,吸取上層澄清的液體500μl移至另一潔凈的EP管內(nèi),并加入等體積(500μl)的異丙醇,輕輕混勻后靜置10min。
4、于4℃,10000g離心10min去上清。離心后可能在管壁或管底出現(xiàn)膠狀白色沉淀物,小心操作,避免沉淀物流失。
5、加入1ml 預(yù)冷的75%無水乙醇(DEPC水配置)至EP管內(nèi),并用手指輕輕彈起沉淀物,然后4℃,10000g離心5min。
6、小心棄去上清液,于室溫靜置干燥2-5min,注意不能過分干燥。
7、將RNA溶于20-50μl DEPC水,必要時可55-60℃水浴3-5min。水浴過程中,EP管蓋需密閉。 所提RNA可用于后續(xù)試驗或者保存于-80℃。
注意事項:
1、提取之前,將所需實驗物品全部放置于超凈臺內(nèi),并用祛RNA酶水噴灑臺面,紫外照射15min。
2、提取過程中均需佩戴口罩和手套操作,并經(jīng)常更換手套(一次性手套)。
3、提取過程中,超凈臺周圍應(yīng)盡量避免人員走動,以免RNA酶趁虛而入進入超凈臺。
4、樣品需充分勻漿裂解,否則易造成RNA提取量低。
5、步驟3中,離心管從離心機拿出來的時候要輕巧,以免管內(nèi)物質(zhì)震蕩導(dǎo)致下層沉淀激起。吸取上清的時候一定要動作輕,切忌吸取太多,少量即可,吸到400-500μl就OK了,再多就容易碰到下層沉淀了。
6、步驟5中,一定把沉淀彈起來,讓浮在酒精中,然后放1-2min,讓酒精充分接觸沉淀,充分溶解有機試劑,然后再離心。但是有時也會使一些雜質(zhì)沉淀下來。
7、最后一步溶解RNA時一定要充分。組織提取出來的量還是挺大的,一般50μl左右。
接下來還有兩期分子生物學(xué)小經(jīng)驗與大家分享,敬請期待!