【背景】

CIK 是「Cytokine-Induced Killer Cells」的縮寫，中文全稱為「細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞」。 CIK 是單個(gè)核細(xì)胞在 CD3 單抗和多種細(xì)胞因子 （包括 IFN-γ, IL-2 等） 的作用下培養(yǎng)獲得的一群以 CD3+CD56+細(xì)胞為主要效應(yīng)細(xì)胞的異質(zhì)細(xì)胞群， 其既具有 T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活 性，又具有 NK 細(xì)胞 （自然殺傷細(xì)胞） 的非 MHC （主要組織相容性抗原） 限制性腫瘤殺傷能力。 CIK 細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對(duì)正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點(diǎn)，是目前 臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。

DC 是「Dendritic  Cells」的縮寫，中文全稱為「樹突狀細(xì)胞」，因其成熟時(shí)伸出許多樹 突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由 2011 年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者、加拿大籍科學(xué)家 Ralph M. Steinman 于 1973 年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞 （Antigen Presenting Cells, APC）。已證實(shí)，DC 是唯一能夠顯著刺激初始 T 細(xì)胞 （Naïve  T cells） 增殖的 APC,而其它 APC （如單核巨噬細(xì)胞，B 細(xì)胞等） 僅能刺激已活化的或記憶性的 T 細(xì)胞。DC 是機(jī)體適應(yīng)性 T 細(xì)胞免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

DC-CIK 即 DC 和 CIK 細(xì)胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴(yán)格的說，最終的效應(yīng)細(xì) 胞是經(jīng) DC 體外活化的 CIK 細(xì)胞。多項(xiàng)研究表明，DC 與 CIK 具有協(xié)同作用，共同孵育后， DC 表面共刺激分子的表達(dá)及抗原遞呈能力均明顯提高，而 CIK 的增殖能力和體內(nèi)外細(xì)胞毒 活性也得以增強(qiáng)，因此 DC-CIK 較單獨(dú)的 CIK 治療更為有效。若將腫瘤抗原負(fù)載的 DC 與 CIK 共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的 T 細(xì)胞，這樣的 DC-CIK 治療則兼具特異性和非 特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負(fù)載腫瘤抗原的 DC 刺激活化的 CIK 活性更強(qiáng)，常被用于 臨床和科研。

【培養(yǎng)原理】

1.DC 培養(yǎng)用細(xì)胞因子：

GM-CSF （粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子）：

GM-CSF 是一種造血生長(zhǎng)因子，在體外可刺激中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的集落形成， 并具有促進(jìn)早期紅巨核細(xì)胞、嗜酸性祖細(xì)胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF 是最早被鑒定 出來對(duì)于 DC 有作用的細(xì)胞因子之一。

GM-CSF 在 DC 培養(yǎng)中的功能是促進(jìn)單核細(xì)胞向大巨噬樣細(xì)胞分化，細(xì)胞表面 MHC II 類分子的表達(dá)得以提高，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF 還可促進(jìn) DC 的存活。

IL-4 （白細(xì)胞介素-4）

IL-4 在由單核細(xì)胞誘導(dǎo)成 DC 的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細(xì)胞的過度生長(zhǎng)，從 而引導(dǎo)單核細(xì)胞向 DC 方向分化。若培養(yǎng)體系中不加 IL-4,單核細(xì)胞將分化為巨噬細(xì)胞。

同時(shí)，IL-4 還有降低細(xì)胞表面表達(dá) CD14 分子的能力。CD14 表達(dá)水平的降低是單核細(xì) 胞分化為 DC 的重要標(biāo)志。

GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使單核細(xì)胞定向分化為未成熟 DC  （immature  DC），此時(shí)的 DC 具有較強(qiáng)的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細(xì)胞表面中度表達(dá) MHC I 類、II 類分子和 B7 家族分子 （CD80, CD86 等），但不表達(dá) CD14.

TNF-α （腫瘤壞死因子-α）

TNF-α可下調(diào)未成熟 DC 的巨胞飲作用和表面 Fc 受體的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi) MHC II 類 分子區(qū)室 （class II compartment） 消失，但能夠上調(diào)細(xì)胞表面 MHC I 類、II 類分子和 B7 家 族分子 （CD80, CD86 等） 的表達(dá)，使未成熟 DC 分化為成熟 DC（mature DC），此時(shí) DC 的 抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強(qiáng)，可極強(qiáng)的激活 T 細(xì)胞。

2.CIK 培養(yǎng)用細(xì)胞因子和抗體：

CD3 激發(fā)型單抗：

T 細(xì)胞活化的第一信號(hào)來自于 T 細(xì)胞表面的受體，即 T 細(xì)胞抗原受體 （T cell antigen receptor,  TCR） 與 APC 提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是 T 細(xì)胞對(duì)抗原的特異性識(shí)別。 TCR 是由 2 條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在 T 細(xì)胞表面，其與 CD3 分子通過非共價(jià)鍵 結(jié)合，形成 TCR/CD3 復(fù)合體。TCR 識(shí)別特異性抗原后會(huì)引起 CD3 和 T 細(xì)胞表面的輔助 受體 CD4 或 CD8 分子的胞漿尾部聚集，進(jìn)而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶 （Lck, Fyn 和 ZAP-70 等），促使 CD3 分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序 （immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM） 中的酪氨酸 （Y） 磷酸化。磷酸化的酪氨酸 （pY） 進(jìn)一步 磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級(jí)聯(lián)反應(yīng) （磷脂酰肌醇途徑或 MAP 激 酶途徑等），最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控 T 細(xì)胞增殖和活化的靶基因 （如 IL-2 和 IFN-γ 等），引起基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，T 細(xì)胞因而由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)為 增殖和活化狀態(tài)。

由上可見，CD3 分子在 T 細(xì)胞活化信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā) 型單抗與 T 細(xì)胞表面 CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起 CD3 分子胞漿區(qū) ITAM 基序中酪 氨酸的磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致 T 細(xì)胞增殖和活化的下游信號(hào)的激活，從而使 T 細(xì)胞增殖和活 化。也就是說，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與 TCR/CD3 復(fù)合物的識(shí)別和激活過程， 從而引起 T 細(xì)胞的增殖與活化，因此是 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。

此外，CD3 激發(fā)型單抗在選用時(shí)一定要注意克隆號(hào)。研究表明，僅克隆號(hào)為 OKT-3 的 CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的 T 細(xì)胞的增殖，而其它克隆號(hào)的 CD3 激發(fā)型單抗 僅能刺激一部分人的 T 細(xì)胞。因此，在進(jìn)行 CIK 培養(yǎng)時(shí)，最好選用 OKT-3 克隆，以保 證每個(gè)患者的 T 細(xì)胞均能被激活。

IL-2 （白細(xì)胞介素-2）

IL-2 最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被稱為 T 細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （T cell growth factor, TCGF），是引起 T 細(xì)胞 增殖最重要的細(xì)胞因子。IL-2 既是自分泌細(xì)胞因子，也是旁分泌細(xì)胞因子，其通過與 T 細(xì)胞表面的 IL-2 受體 （IL-2R） 的特異性結(jié)合而促使 T 細(xì)胞活化，并進(jìn)入細(xì)胞分裂狀態(tài)。

此外，IL-2 還可刺激 NK 細(xì)胞的生長(zhǎng)并增強(qiáng)其殺傷能力。因此 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)中須添加IL-2,以促進(jìn) T 細(xì)胞的增殖與活化。

IFN-γ （干擾素-γ）

IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細(xì)胞表面 IL-2R 表達(dá)的作用，因此會(huì)增強(qiáng) T 細(xì)胞對(duì) IL-2 促 增殖反應(yīng)的敏感度和強(qiáng)度。在誘導(dǎo) CIK 細(xì)胞形成的過程中加入 IFN- g ,可降低 IL-2 的用量。 研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與 CIK 的細(xì)胞毒活性密切相關(guān)。先加入 IFN- g,培養(yǎng)24后再 加入 IL-2,可明顯提高 CIK 的細(xì)胞毒活性。

IL-1α（白細(xì)胞介素-1α）

IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞表面上調(diào)表達(dá) IL-2R.當(dāng) IL-1α與 IFN-γ和激發(fā)型CD3 單抗合用時(shí)，可以明顯提高 CIK 的細(xì)胞毒作用。

【細(xì)胞制備】

1. 外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集

1.1用血細(xì)胞分離機(jī)采集患者自身的外周血單個(gè)核細(xì)胞 80 - 100 ml。

1.2淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化單個(gè)核細(xì)胞 （PBMC）。

1.3無血清培養(yǎng)液洗滌 2 次，獲得純度在 90% 以上的 PBMC,細(xì)胞數(shù)量需達(dá)到 1-3 x108。

2. （可選步驟）  腫瘤抗原的制備

用于負(fù)載 DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽 （Tumor-Specific  Antigens,  TSA）或腫瘤相關(guān)抗原 （Tumor-αssociated Antigens, TAA），也可以是腫瘤全細(xì)胞抗原。

用 TSA 或 TAA 負(fù)載的 DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性 抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細(xì)胞等缺陷。而用腫瘤全 細(xì)胞抗原負(fù)載 DC 可克服這些缺陷，因?yàn)榇藭r(shí)無需知道那些抗原是腫瘤細(xì)胞的 TSA 或 TAA,而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊 DC 可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)不同抗原決定簇的細(xì) 胞毒 T 淋巴細(xì)胞 （CTL） 克隆，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的有效殺傷。

腫瘤細(xì)胞全抗原負(fù)載 DC 的方法很多，包括用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載 DC、用凋亡腫 瘤細(xì)胞負(fù)載 DC、用壞死或死亡的腫瘤細(xì)胞負(fù)載 DC,用腫瘤活細(xì)胞負(fù)載 DC,和將腫瘤 細(xì)胞與 DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細(xì)胞裂解液負(fù)載 DC,因該方法簡(jiǎn)單、 快速、有效。

反復(fù)凍融是獲得腫瘤細(xì)胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：

2.1手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；

2.2無菌生理鹽水洗 3 次；

2.3用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入 RPMI 1640 培養(yǎng)基，充分研磨；

2.4200 目無菌網(wǎng)過濾后收集單細(xì)胞懸液；

2.5用 RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 1-2 x 107/ml,裝入 5 ml 無菌凍存管中；

2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入 37oC 水浴中解凍 10 min。反復(fù) 3-5 次；注：也可以-80oC/37oC 反復(fù)凍融 3-5 次。

2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm,離心 10 min；

2.8收取上清，0.22mm 濾膜過濾除菌，留樣檢測(cè)蛋白含量及細(xì)菌、真菌和支原體；2.9-80oC 保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

3. CIK 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

3.1 步驟 1 中獲得的 PBMC 用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 2 x 106/ml,置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)；

3.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育 2 h,以使單核細(xì)胞貼壁。

3.3 收集懸浮細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至 1-2 x 106/ml。

3.4 加入 1,000 U/ml  的重組人 IFN-γ 培養(yǎng)；

3.5 24 h  后加入 50ng/ml  的 CD3  單克隆抗體和 300 U/ml  的重組人 IL-2,刺激 CIK  細(xì) 胞的生長(zhǎng)和增殖；注：此時(shí)也可同時(shí)加入 100 U/ml 的重組人 IL-1α.

3.6 每 3 天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人 IL-2 300 U/ml；

3.7在培養(yǎng)的第 7d,收獲 CIK 細(xì)胞，此時(shí)數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1x 109 個(gè)以上。

3.8 CIK 細(xì)胞質(zhì)控：

3.8.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在 80% 以上；3.8.2 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面  CD3、CD8  和 CD56  等分子的表達(dá) ,觀察CD3+CD56+細(xì)胞的比例是否明顯提高。

4. DC 細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

4.1 步驟 3.2 中剩下的貼壁細(xì)胞 （主要是 CD14+的單核細(xì)胞），加入含重組人 GM-CSF500-1,000U/ml 和重組人 IL-4 500U/ml 的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向 DC 細(xì)胞分化。

4.2 每 3d 半量換液一次，并補(bǔ)足細(xì)胞因子；

4.3（可選步驟） 在培養(yǎng)的第 5d, 加入步驟 2 中獲得的腫瘤抗原 50 mg/ml,對(duì) DC 進(jìn) 行抗原負(fù)載；注：若不對(duì) DC 進(jìn)行抗原負(fù)載，該步省略。

4.4 在培養(yǎng)的第 6d,加入重組人 TNF-α（500U/ml），誘導(dǎo) DC 細(xì)胞成熟。

4.5在培養(yǎng)的第 7d 或第 8d,收獲 DC  細(xì)胞，其數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1×106  個(gè)以上。

4.6DC 的質(zhì)檢：

4.6.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力：活細(xì)胞應(yīng)在 80% 以上；

4.6.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) DC 細(xì)胞表面 HLA-DR、CD83 和 CD86 等分子的表達(dá)，以 確定 DC 是否成熟。

5. DC-CIK 細(xì)胞的制備和質(zhì)檢

5.1 收集步驟 4 和步驟 3 中所獲得的 DC 細(xì)胞和 CIK 細(xì)胞，按 1∶10 （數(shù)目比） 的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人 IL-2 （300 U/ml）。

5.2每 3 天半量換液一次，并補(bǔ)加重組人 IL-2 （300U/ml）。

5.3 在第 7d  收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量應(yīng)達(dá)到 1×1010 個(gè)以上。

5.4 DC-CIK 細(xì)胞的質(zhì)檢：

5.4.1 臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)：活細(xì)胞應(yīng)在 80% 以上；

5.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面 CD3、CD8、CD56 等分子的表達(dá)：CD3+CD56+細(xì) 胞的比例應(yīng)在 20% 以上。

5.4.3 細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)：以 DC-CIK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，以腫瘤細(xì)胞 （可為原代腫瘤細(xì) 胞或腫瘤細(xì)胞株） 為靶細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞按 10 : 1（數(shù)目比）  的比例加 入 96 孔 U 型板中，每孔含靶細(xì)胞 1 x 104 個(gè)，終體積為 200 ml，設(shè) 3 個(gè)復(fù) 孔。培養(yǎng) 4 h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶 （LDH） 試劑盒檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞 對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率。

5.4.4 收獲細(xì)胞前，取少量培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)菌、真菌培養(yǎng)，并檢測(cè)支原體、衣原體， 及內(nèi)毒素 （標(biāo)準(zhǔn)：病原學(xué)檢測(cè)陰性，內(nèi)毒素<5 Eu）。

【步驟簡(jiǎn)圖】

【推薦試劑】

注：Animal Free 意為無動(dòng)物成分。無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞因子在生產(chǎn)過程中不會(huì)有任何動(dòng)物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動(dòng)物成分。這樣可避免動(dòng)物病原體 （如瘋牛病，克雅氏病等） 的污染 及外源蛋白引起的機(jī)體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細(xì)胞治療的體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中最好使用無動(dòng)物成分的重組細(xì)胞 因子。

【其它相關(guān)試劑】

 

【參考文獻(xiàn)】

[1] Steinman RM, Cohn ZA. “Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution”. J. Exp. Med. 1973; 137 （5）：1142–62.

[2]  張志偉，宋鑫。DC-CIK 細(xì)胞臨床制備規(guī)范化研究。中國(guó)腫瘤，2011;20（2）：85-88.

[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer:a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133