核酸檢測(cè)革命：可替代PCR的犀利技術(shù)——RPA

重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。

RPA原理介紹

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非�？�，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。

RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。PCR引物多半是不適用的，因?yàn)镽PA引物比一般PCR引物長(zhǎng)，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基。引物過短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測(cè)靈敏度。在設(shè)計(jì)RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴(kuò)增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計(jì)不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。

RPA技術(shù)有哪些優(yōu)勢(shì)

常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的最適溫度在37℃-42℃之間，無(wú)需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。

據(jù)介紹，RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測(cè)。

RPA既可以擴(kuò)增DNA也可以擴(kuò)增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測(cè)，還可以對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。

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