實(shí)驗(yàn)試劑

膠原酶V，512 kut/mg(Sigma公司)，DNA酶(Sigma公司)，胎牛血清(Gibco公司)，RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，Dextran(Pharmacia公司)，Hanks平衡鹽溶液(Gibco公司)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

離心機(jī)，注射器，顯微鏡，超凈工作臺(tái)等。

實(shí)驗(yàn)材料

成年雜種豬，豬齡12 mo，體質(zhì)量150 kg左右，豬被屠宰放血后，在相對(duì)無菌條件下迅速取出胰腺，保存于4℃ Hanks液中送至實(shí)驗(yàn)室，熱缺血時(shí)間少于10 min，冷缺血時(shí)間少于90 min。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 胰島分離

胰腺取回后，置于超凈工作臺(tái)上，快速去除胰周組織、脂肪、血管及外科被膜，保留固有被膜。從胰頭、胰體交界部橫斷胰腺，找到主胰管，用20 G套管針插入，縫合線結(jié)扎，尾部遠(yuǎn)端亦結(jié)扎切斷，每次均取約15-20 g組織，注入4℃含Ca2 Hanks液配制的復(fù)合膠原酶溶液(1.5 g/L，內(nèi)含DNA酶0.3 g/L)，注入量 = 胰質(zhì)量×2，注射速度7 mL/min，3-4 min內(nèi)完成，置入玻璃容器內(nèi)，在38.5±0.1℃水浴中震蕩消化，震速100 r/min，在消化過程中間斷加入0.1 mmol/L的NaOH，使消化液pH值盡可能維持在7.8左右，從消化20 min開始每間隔4 min取樣一次，雙硫腙染色鏡檢，當(dāng)胰腺組織被消化裂解成細(xì)沙狀，鏡檢見大部分結(jié)構(gòu)完整的胰島從外分泌組織中脫落出來，立即用4℃冷Hanks液(含100 mL/L胎牛血清)終止消化，充分混勻后，用40目鋼網(wǎng)過濾，收集消化后組織，4℃離心冼滌2次，去除脂肪等雜質(zhì)細(xì)胞，取樣鏡檢計(jì)數(shù)和觀察消化后胰島分離情況。

2. 胰島純化

用Dextran配制成密度為1.037，1.054，1.070，1.096，1.11 kg/L的不連續(xù)密度梯度液，依次將不連續(xù)密度梯度液各10 mL加入50 mL離心管中，最后將洗滌后的消化組織每0.5 mL與1.037 kg/L密度梯度液10 mL混勻，小心移至離心管中液體上層，形成不連續(xù)密度梯度。將2-4個(gè)離心管置入低溫離心機(jī)中，先800 r/min離心5 min，然后2 500 r/min離心15 min，離心后在1.096-1.054 kg/L之間收集純化的胰島，4℃離心洗滌2次。分別取樣鏡檢計(jì)數(shù)，估計(jì)純度和行生物學(xué)活性及組織學(xué)鑒定。

3. 胰島計(jì)數(shù)和純度測(cè)定

分離純化后的組織懸液用雙硫腙(雙硫腙10 mg，無水乙醇3 mL，250 g/L氨水50 mL)進(jìn)行染色，光鏡下胰島細(xì)胞團(tuán)染成腥紅色或紅色，外分泌組織不著色，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形.在顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑≥50 mm的胰島算出每克胰腺組織分離的胰島當(dāng)量數(shù)，純度用內(nèi)、外分泌組織量的比值來估計(jì)。

4. 胰島生物學(xué)活性鑒定

將純化后胰島細(xì)胞懸液放置在顯微鏡下，用巴氏吸管吸取胰島放入培養(yǎng)板中，每10個(gè)胰島當(dāng)量(每1個(gè)胰島當(dāng)量相當(dāng)于直徑150 mm的胰島細(xì)胞團(tuán)，IE)的成年豬胰島(APIs)置入一個(gè)培養(yǎng)孔，6孔為1組，共4組.每組分別置入無糖培養(yǎng)基、含5.6 mmoL/L葡萄糖(低糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖(高糖)、16.7 mmoL/L葡萄糖加10 mmoL/L茶堿(高糖 茶堿)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、含50 mL/L CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，收集培養(yǎng)液，用胰島素放免試劑盒(中科院原子能研究所)測(cè)定胰島素含量.

5. 胰島組織學(xué)檢查

離心純化后胰島細(xì)胞懸液，收集胰島組織，用無水酒精固定，石蠟包埋切片，HE染色檢查胰島組織結(jié)構(gòu)完整性。

6. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)以mean±SD表示，組間均數(shù)差異用t檢驗(yàn)比較，P<0.05為有差異。