實(shí)驗(yàn)步驟

1. 蛋白質(zhì)雙向電泳

1) 第一向固相pH梯度等電聚焦電泳

a. 上樣：第一向等電聚焦采用膠內(nèi)加樣的方法進(jìn)行。精確吸取一定量的蛋白樣品(銀染樣品的蛋白上樣量為140 ug計(jì)，考染樣品為1.3 mg)加入重泡漲液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量濱酚藍(lán)，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使終體積達(dá)到350ul�；靹蚝缶鶆蚣釉贗PG膠條holder的正、負(fù)極之間。將預(yù)制IPG膠條(pH 3 -10 NL)除去保護(hù)膜，膠面向下，覆于holder中的樣品之上；慢慢下壓膠條，并前后移動(dòng)，避免生成氣泡。在膠條上方均勻封以1 ml覆蓋油，蓋上蓋子。

b. 等電聚焦：將裝有樣品和IPG膠條的strip holder置一向電泳儀(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦參數(shù)：0V電壓下泡漲3h，30V電壓下泡漲10 h，500 V電壓下電泳0.5 h，2000V電壓下電泳0.5 h，5000 V電壓下電泳0.5 h，8000 V電壓下電壓20 h。

c. 膠條的平衡：第一向電泳結(jié)束后，取出IPG膠條平衡兩次，每次15 min。平衡緩沖液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚藍(lán)，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可減少電內(nèi)滲，有利于蛋白質(zhì)從第一向轉(zhuǎn)移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去第一步平衡時(shí)的DTT。平衡后的IPG膠條沿邊緣用濾紙吸去多余的平衡液。

2) 第二向垂直SDS-PAGE

根據(jù)IPG conversion Kit的體積，配制大小為200 mmX200 mmX 1mm，濃度為12.5%T，3.3%C的均勻膠。將平衡好的IPG膠條移至凝膠上方，用0.5%瓊脂糖電泳緩沖液封閉。電泳的緩沖液系統(tǒng)為Tris-Glycine-SDS系統(tǒng)(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向膠條和二向膠接觸面避免氣泡產(chǎn)生；封膠溫度不能過高，封膠時(shí)不要引入氣泡。

電泳參數(shù)設(shè)置：14-15℃恒溫下，以每膠條計(jì)

20 mA恒流電泳40 min

30 mA恒流電泳至澳酚藍(lán)電泳到底部。

2. 染色

1) 銀染法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(40%無水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；棄固定液換敏化液(30%無水乙醇，6.8%醋酸鈉，0.2%硫代硫酸鈉，0.5%戊二醛)敏化30 min；棄敏化液，以雙蒸水200 ml洗2次，每次30 min；之后置于銀染液((0.25%硝酸銀，40%甲醛)染色20 min，染色時(shí)避光；棄銀染液，以雙蒸水200ml洗2次，每次1 min；顯色液((2.5%碳酸鈉，20%甲醛)顯色2-5 min，至蛋白質(zhì)點(diǎn)完全顯現(xiàn)為止；棄顯色劑，立即換終止液(1.46 %EDTA)，終止顯色10 min；以超純水洗3次，每次5 min。

2) 考馬斯亮藍(lán)染色(考染)法：將二向電泳完成后的SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至固定液(50%無水乙醇，10%冰醋酸的水溶液)中，固定30 min以上；棄固定液，加入染色液(10%冰醋酸，G-350過濾所得)，熱染10 min；之后轉(zhuǎn)移至脫色液中(10%冰醋酸水溶液)過夜，直至背景色脫盡；超純水清洗。

3. 圖像分析

以ImageScanner光學(xué)掃描儀在256色和300 dpi分辨率下對凝膠進(jìn)行掃描。以Image Master 2D Elite 3.01分析軟件完成圖像分析。

4. 肽質(zhì)量指紋譜(Peptide mass fingerprinting，PMT)分析樣品制備

    1) 脫色：選取2D膠上目的蛋白斑點(diǎn)，用干凈解剖刀片沿染色邊緣切下蛋白點(diǎn)，并切成1-2 mm大小的膠片，另切一塊無蛋白的2D膠作空白對照，用水清洗幾次后用含50%乙睛，25 mmol/I，NH4CO3溶液振搖20 min，棄去溶液，重復(fù)1-2遍至膠片中的藍(lán)色褪盡。

    2) 酶切：將膠片真空離心干燥20 min，使其完全脫水體積縮小，胰蛋白酶用25 mmol/L NH4CO3溶液配成0.01ug/ul，加入10ul于各樣品管中，4℃冰箱中放置30 min，待酶液完全被吸收，37℃保溫反應(yīng)(封口)12 h。

    3) 肽提�。杭�5 % TFA(三氟醋酸)溶液120 ul于40℃保溫1h，吸出上清液，加2.5%TFA，50%ACN(乙睛)溶液120 ul于30oC保溫1h，吸出上清液，合并上清液，冰凍干燥。

5. 差異蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜分析

凍干后用10ul0.5%TFA溶解膚混合物或脫鹽后的提取液，用Bruker公司的質(zhì)譜儀REFLEX III基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix  assisted  laser  desorption/ionization  time  of  flight  massspectrometry，MALDI-TOF-MS)進(jìn)行分析。取1ul點(diǎn)靶，另取1ul a-氰基-4-經(jīng)基肉桂酸溶于0.1 % TFA/50 % ACN的飽和溶液作基質(zhì)，室溫干燥。質(zhì)譜儀采用激光波長337 nm，反射檢測。

6. 數(shù)據(jù)庫檢索初步鑒定蛋白質(zhì)

數(shù)據(jù)庫檢索程序根據(jù)輸入的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)、分子量范圍及膚指紋譜數(shù)據(jù)和其它一些參數(shù)在數(shù)據(jù)庫中尋找與這些參數(shù)相匹配的蛋白質(zhì)。檢索數(shù)據(jù)庫程序?yàn)椋篽ttp://www.matrixscience.com