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動(dòng)物組織塊DNA的提取實(shí)驗(yàn)介紹

瀏覽次數(shù):1148 發(fā)布日期:2015-6-8  來(lái)源:上海北諾生物科技有限公司

實(shí)驗(yàn)原理
DNA是一切生物細(xì)胞的重要組成成分,主要存在于細(xì)胞核中。通過(guò)研磨和SDS作用破碎細(xì)胞;苯酚和氯仿可使蛋白質(zhì)變性,用其混合液(酚:氯仿:異戊醇)重復(fù)抽提,使蛋白質(zhì)變性,然后離心除去變性蛋白質(zhì);RNase降解RNA,從而得到純凈的DNA分子。

實(shí)驗(yàn)試劑
1.生理鹽水
2.十二烷基硫酸鈉(SDS)
3.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
4.乙二胺四乙酸(EDTA)
5.飽和酚
6.氯仿
7.異戊醇
8.無(wú)水乙醇
9.75%乙醇
10.蛋白酶K
11.RNase酶(

試劑配制
1.Tris–HCL 1mol/L PH8.0 50ml
配制方法:
40ml雙蒸水,6.057g固體Tris放入燒杯中溶解,用濃鹽酸調(diào)PH值到8.0,轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中,加入雙蒸水定容,搖勻后,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中,貼上標(biāo)簽,高壓滅菌后,降至室溫,4℃保存?zhèn)溆谩?BR>2.生理鹽水: 0.85%NaCL 100ml
配制方法:
在20ml雙蒸水中溶解0.85g固體NaCL,加水定容至100ml,搖勻后,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中,貼上標(biāo)簽,高壓滅菌后,降至室溫,4℃保存?zhèn)溆谩?BR>3.EDTA 0.5mol/L PH8.0 50ml
配制方法:
將9.08g的EDTA·Na2·2H2O溶解于40ml雙蒸水,用1g的NaOH顆粒(慢慢逐步加入)調(diào)PH值到8.0,用50ml容量瓶定容,如果EDTA難溶,先加NaOH溶解,然后逐步加EDTA·Na2·2H2O。
4.TES緩沖液(釋放DNA) 100ml
配制方法:
將0.5844g的5 mol/lNaCl溶解于80ml雙蒸水,在分別加入1ml的0.5 mol/l EDTA、0.2ml的Tris-HCl (pH=8.0),加定容至100ml, 搖勻后,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中,貼上標(biāo)簽,高壓滅菌后,降至室溫,4℃保存?zhèn)溆谩?BR>5.10% SDS(變性劑破細(xì)胞壁)100ml
配制方法:
將10g的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解于80ml雙蒸水于68℃加熱溶解,用濃HCl調(diào)至PH=7.2,定容至100ml,搖勻后,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的輸液瓶中,貼上標(biāo)簽,4℃保存?zhèn)溆谩?BR>6.蛋白酶K(降解蛋白質(zhì)):20mg/mL 無(wú)菌三蒸水溶解。
7.RNA酶(降解RNA)
配制方法:
將胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/L的Tris·CL(PH7.5)、15mmol/LNaCL中,配成10mg/ml的濃度,于100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫,分裝成小份存于–20℃。
8.氯仿:異戊醇=24:1 100ml
按24:1的比例加入氯仿、異戊醇,搖勻,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的瓶中,貼上標(biāo)簽,4℃保存?zhèn)溆谩?BR>9.TE緩沖液(溶解DNA) PH8.0 50ml
配制方法:
將0.5ml 的10mmol Tris-HCl(PH8.0) 、0.1ml的0.5mol/l EDTA(PH8.0) 加入到50ml的容量瓶中,調(diào)PH8.0定容至50ml搖勻后,轉(zhuǎn)到準(zhǔn)備好的瓶中,貼上標(biāo)簽,高壓滅菌后,降至室溫,4℃保存?zhèn)溆谩?/P>

實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1.高速離心機(jī)
2.烘箱
3.冰箱
4.水浴鍋
5.微量移液器
6.高壓滅菌鍋

7.手術(shù)剪刀、鑷子、吸水紙
8.微量取液器
9.研缽、1.5mL 離心管、一次性手套、1.5mL離心管架、記號(hào)筆等

實(shí)驗(yàn)材料
動(dòng)物組織塊

實(shí)驗(yàn)步驟
1.組織塊解凍,用生理鹽水洗去血污,剪取約0.5g組織,放入1.5ml離心管中,剪碎。
2.加入0.45ml TES混勻,再加入50ul SDS(10%),5.0ul蛋白酶K(20mg/ml),充分混勻后,于56°C保溫4-6h,每2h搖1次。
3.放置到室溫,加入等體積飽和酚(500ul),顛倒混勻,10000r/m,離心10m,分離水相和有機(jī)相,小心吸取上層含核酸的水相,到一個(gè)新的1.5ml離心管。
4.加入等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻,10000r/m,離心10分鐘,取上層轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中。
5.加入等體積氯仿:異戊醇(24:1),顛倒混勻,10000r/m,離心10分鐘,取上層清液到一個(gè)新的1.5ml離心管。
6.加入2.5倍體積的-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA,觀(guān)察現(xiàn)象。
7.12000 r/m,離心10分鐘,棄乙醇。
8.-20°C保存的75%乙醇洗滌,10000 r/m,離心5分鐘,去乙醇,55°C干燥DNA。
9.加入適量TE溶解DNA(具體依DNA的多少而定),-20°C保存?zhèn)溆谩?BR>
注意事項(xiàng)
1.抽提每一步用力要柔和,防止機(jī)械剪切力對(duì)DNA的損傷。
2.取上層清液時(shí),注意不要吸起中間的蛋白質(zhì)層。
3.乙醇漂洗去乙醇時(shí),不要蕩起DNA。
4.離心后,不要晃動(dòng)離心管,拿管要穩(wěn),斜面朝外

來(lái)源:上海北諾生物科技有限公司
聯(lián)系電話(huà):021-57730393,15800960770
E-mail:beinuobio@163.com

標(biāo)簽: 動(dòng)物組織 DNA 提取
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