二、靶基因樣品的制備

與普通分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)一樣，靶基因的制備需要運(yùn)用常規(guī)手段從細(xì)胞和組織中提取模板分子，進(jìn)行模板的擴(kuò)增和標(biāo)記�；�因芯片包括大量探針分子，因此，靶基因樣品的制備方法將根據(jù)基因芯片的類型和所研究的對象(如mRNA 、DNA等)而決定。對于大多數(shù)基因來說，mRNA 的表達(dá)水平大致與其蛋白質(zhì)的水平相對應(yīng)，因此，對細(xì)胞內(nèi)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測對于了解細(xì)胞的性質(zhì)與狀態(tài)十分重要。用基因芯片可以對細(xì)胞內(nèi)大量基因的mRNA表達(dá)差異進(jìn)行檢測，其靶基因的制備一般采用RT-PCR方法以寡聚dT作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

待測樣品的標(biāo)記，主要采用熒光分子。常規(guī)標(biāo)記的過程是通過在擴(kuò)增過程中加入含有熒光標(biāo)記的dNTP（至少一種為熒光標(biāo)記的），熒光標(biāo)記的單核苷酸分子，在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中，被引入新合成的DNA片段。后者變性后，即可與基因芯片上的微探針陣列進(jìn)行分子雜交。也可采用末端標(biāo)記法，直接在引物上標(biāo)記熒光。即在引物合成時通過應(yīng)用熒光標(biāo)記的dNTP制備熒光標(biāo)記引物，或通過標(biāo)記生物素，進(jìn)行熒光標(biāo)記。

對于陣列密度較小的基因芯片(經(jīng)常用膜片作為基底)可以用同位素檢測法，采用³²P標(biāo)記技術(shù)，這樣可以運(yùn)用現(xiàn)在普通使用的同位素顯影技術(shù)和儀器。但是，在使用同位素靶基因標(biāo)記法過程中，一些表達(dá)量高雜交信號強(qiáng)的點(diǎn)陣，容易在其周圍產(chǎn)生光暈，當(dāng)其周圍點(diǎn)陣的雜交信號較弱時，其雜交信號容易受到強(qiáng)雜交信號的掩蓋。 
 

三、靶基因的雜交及其信號的檢測

cDNA基因芯片與靶基因的雜交過程與一般常規(guī)的分子雜交過程基本相同。在基因芯片的雜交檢測中，為了更好的比較不同來源樣品的基因表達(dá)差異，或者為了提高基因芯片檢測的準(zhǔn)確性和測量范圍，通常使用多色熒光技術(shù)。即把不同來源的靶基因用不同激發(fā)波長的的熒光探針來修飾，并同時使它們與基因芯片雜交。通過比較芯片上不同波長熒光的分布圖，可以直接獲得不同樣品中基因表達(dá)的差異。

人們還發(fā)展了其它靈敏度高、特異性好的基因芯片雜交檢測方法。例如短序列偶聯(lián)法。該方法首先將非標(biāo)記的DNA靶序列與基因芯片上探針陣列進(jìn)行完全雜交，若基因芯片上探針的固定端是5’端時，繼續(xù)以靶基因?yàn)槟０�，可以在暴露于溶液中�?’-OH上用DNA聚合酶合成上新的帶有熒光標(biāo)記的堿基（ddNTPs）。通過檢測ddNTP可以分辨出靶序列的基因。 

美國Nanogen公司提出了一種通過交變電場加速基因芯片的雜交速度的主動式基因芯片。他們利用核酸分子所帶的負(fù)電性質(zhì)，通過快速反轉(zhuǎn)電場的極性，使靶基因與探針間產(chǎn)生快速結(jié)合和分離。通過控制電場的大小，使得完全匹配雜交的核酸分子保留在陣列表面，而非特異性結(jié)合的DNA在電場的作用下與探針分離。這種芯片的分子雜交速度可縮短至1分鐘以下甚至數(shù)秒（cheng et al，1998），因此有較廣闊的應(yīng)用前景。