細(xì)胞外囊泡

細(xì)胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是指從細(xì)胞膜上脫落或者由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡狀小體，直徑從40nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡（Microvesicles,  MVs）和外泌體（Exosomes, Exs）組成，微囊泡是細(xì)胞激活、損傷或凋亡后從細(xì)胞膜脫落的小囊泡，直徑約為100nm – 1000nm；

外泌體由細(xì)胞內(nèi)的多泡小體（multivesicular bodies）與細(xì)胞膜融合后以外分泌的形式釋放到細(xì)胞外，直徑約為40nm - 100nm。細(xì)胞外囊泡廣泛存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清以及各種體液（血液、淋巴液、唾液、尿液、精液、乳汁）中，攜帶有細(xì)胞來(lái)源相關(guān)的多種蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、DNA、mRNA、miRNA等，參與細(xì)胞間通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎癥疾病以及癌癥中都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類(lèi)疾病的診斷標(biāo)志物，因此，對(duì)細(xì)胞外囊泡進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量研究顯得尤為重要。
 
細(xì)胞外囊泡的檢測(cè)方法

目前細(xì)胞外囊泡（EVs）的檢測(cè)方法主要有掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、納米微粒追蹤分析術(shù)（NTA）、流式細(xì)胞儀和ELISA等，由于通量高、用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單，ELISA和流式細(xì)胞儀是比較常用的方法。ELISA方法容易受其他可溶性抗原的干擾，而且無(wú)法知道囊泡的大小、數(shù)量等信息；流式細(xì)胞儀不僅可以檢測(cè)囊泡的大小、數(shù)量，而且通過(guò)細(xì)胞特異的標(biāo)記物染色可以檢測(cè)囊泡的來(lái)源，將囊泡進(jìn)行分類(lèi)，因此，流式細(xì)胞儀理論上是進(jìn)行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測(cè)的最優(yōu)選擇。然而，傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀針對(duì)的樣本主要是細(xì)胞，散射光的檢測(cè)極限通常是300-500nm，而大多數(shù)細(xì)胞外囊泡的直徑都在300nm以下，由于無(wú)法與背景噪音區(qū)分，直徑小于300nm的細(xì)胞外囊泡很難被檢測(cè)到，因此，囊泡數(shù)量往往被低估，檢測(cè)結(jié)果自然也不準(zhǔn)確[1]。

Apogee流式細(xì)胞儀的三大優(yōu)勢(shì)

（1）最靈敏的散射光分辨率
英國(guó)Apogee公司的A50-Micro突破傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)極限，優(yōu)化的光學(xué)模塊和優(yōu)異的散射光檢測(cè)能力使得A50-Micro具有無(wú)法匹敵的靈敏度（<100nm）和最好的光散射分辨率（10nm）。圖1展示的是A50-Micro與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀（F500）及一些新型流式細(xì)胞儀（Gallios、Influx）的技術(shù)對(duì)比[1]，通過(guò)前向角散射光FC500只能勉強(qiáng)區(qū)分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠則完全無(wú)法區(qū)分；Gallios和Influx在散射光檢測(cè)能力方面有所提高，可以區(qū)分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠還是無(wú)法區(qū)分；而Apogee A50-Micro可以輕松地將0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成兩個(gè)群（Fig 1.A）。從前向角散射光和側(cè)向角散射光的散點(diǎn)圖中可以看到，無(wú)論是FC500還是Gallios或Influx都只能部分的將0.3μm的微珠與背景噪音區(qū)分開(kāi)，而A50-Micro可以清晰地將0.3μm的微珠與背景噪音完全區(qū)分開(kāi)（Fig1.B中綠色數(shù)據(jù)點(diǎn)），并且只有A50-Micro可以檢測(cè)到0.14μm的微珠（Fig1.B中紫色數(shù)據(jù)點(diǎn)）。這些結(jié)果說(shuō)明，利用Apogee A50-Micro突出的高靈敏度和分辨率，我們可以輕松地將直徑相差10nm以上的細(xì)胞外囊泡樣本進(jìn)行分群、計(jì)數(shù)、分析。另外，多達(dá)9通道熒光檢測(cè)器，可以靈活使用細(xì)胞外囊泡特定抗原熒光抗體進(jìn)行囊泡來(lái)源、數(shù)量的精確分析。Apogee A50-Micro是市場(chǎng)上唯一能夠通過(guò)散射光檢測(cè)小至100nm小顆粒的流式細(xì)胞儀，在細(xì)胞外囊泡的檢測(cè)上優(yōu)于任何一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。

Figure 1. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.
 
（2）專利的折射率校正功能
利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞外囊泡檢測(cè)往往需要使用標(biāo)準(zhǔn)微球（microspheres）來(lái)校正和設(shè)門(mén)（Set Gate），常用的微球材料有聚苯乙烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），國(guó)際血栓與止血協(xié)會(huì)和標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（ISTH SSC）推薦用于循環(huán)微粒（微囊泡）檢測(cè)設(shè)門(mén)的Megamix就是聚苯乙烯微球。但是，最近越來(lái)越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，用標(biāo)準(zhǔn)微球進(jìn)行設(shè)門(mén)存在很?chē)?yán)重的偏差，因?yàn)椴煌�材料的微球的折射率（refractive index）是不一樣的，相同直徑的微球，折射率越大產(chǎn)生的散射光就越強(qiáng)。而且微球的折射率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生物囊泡的折射率，意味著微球產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度是相同直徑囊泡的幾十倍。實(shí)際上，0.5mm聚苯乙烯微球（Megamix）產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度相當(dāng)于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能產(chǎn)生跟0.9mm聚苯乙烯微球（Megamix） 相當(dāng)強(qiáng)度的散射光（表1）[2]。因此，如果我們用0.5mm的聚苯乙烯微球（Megamix）設(shè)門(mén)來(lái)檢測(cè)小于0.5mm的細(xì)胞外囊泡將產(chǎn)生嚴(yán)重的偏差，檢測(cè)結(jié)果也是不可信的。

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).
 
為了解決這一問(wèn)題，Apogee的工程師們研發(fā)了專利的折射率校正功能，無(wú)論是單參數(shù)的柱狀圖（Histogram）還是雙參數(shù)的散點(diǎn)圖（Cytogram），只要單擊右鍵選擇“Choose Calibration Scale”就會(huì)出現(xiàn)一條校正大小的標(biāo)尺，并且可以根據(jù)檢測(cè)樣本的折射率來(lái)選擇相應(yīng)折射率的標(biāo)尺（圖2），那么我們就可以根據(jù)樣本的直徑大小和折射率這兩個(gè)參數(shù)來(lái)設(shè)門(mén)和選擇我們感興趣的區(qū)域（region of interest, ROI），得到真實(shí)可靠的結(jié)果。

圖2.折射率分別為1.38和1.42的微粒（180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm）在散點(diǎn)圖中的位置。

（3）不依賴于抗體微珠的外泌體檢測(cè)能力
由于外泌體（exosomes）的直徑特別小（40 - 100nm），超出了傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)范圍，為此，很多公司提供了特異抗體標(biāo)記的微珠用于外泌體的富集和流式分析，但這種方法的局限是操作復(fù)雜，對(duì)抗體特異性要求很高，而且無(wú)法知道外泌體的絕對(duì)數(shù)量。而Apogee A50-Micro超高的靈敏度和分辨率使其可以直接對(duì)樣本中的外泌體進(jìn)行分析和計(jì)數(shù)，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，美國(guó)個(gè)性化醫(yī)療的領(lǐng)軍生物技術(shù)公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro來(lái)檢測(cè)和分析復(fù)雜病人樣本中的微囊泡和外泌體[3]。一流企業(yè)的選擇，值得您的信賴！

[1] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.
[2] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.
[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.
 
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