實(shí)驗(yàn)試劑

Total RNA Kit ：Omega：(Cat.No．R6834)

First Strand cDNA Synthesis Kit：GeneCopoeia(Cat.No．C0210A)

2xAllinOneTMQ-PCRMix：GeneCopoeia（cat.No．D0101A)

Primer synthesis：invitrogen

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Real Time PCR：ABI

實(shí)驗(yàn)材料

樣品為5個(gè)人源的細(xì)胞培養(yǎng)液，其編號(hào)分別為：NO.I、No.2、No.3、No.4、No.5，其中No.1為對(duì)照組，其它四個(gè)為不同的樣品組。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. RNA抽提

    1) 樣品處理：取適量樣本加入 1ml TRK 裂解液勻漿樣品。室溫 14,000 × g 離心 5 min去除不溶解的的雜質(zhì)，小心轉(zhuǎn)移上清至 1.5ml 離心管。

    2) 加入等倍體積 70% 乙醇至裂解液中，抽打或渦旋混勻。

    3) 將柱子套在收集管中，轉(zhuǎn)移混合液至柱子中。室溫 10,000 × g 離心 30-60 秒，棄去濾液。

    4) 把柱套放新收集管中，加入 300ul RNA Wash Buffer I 至柱子上，按以上條件離心，棄去濾液。把柱套放回收集管中。

    5) DNase 消化: 配制 DNASE 消化液( Digestion Buffer, 73.5ul ; RNase-Free DNase I,1.5ul) ,混勻, 將消化液轉(zhuǎn)移至柱子膜的正中央，室溫靜置 15 分鐘。

    6) 加 500ul RNA Wash Buffer I 至柱子，按以上條件離心，棄濾液。

    7) 把柱套放回收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。

    8) 把柱套放回新收集管中，加 500ul RNA Wash Buffer II 至柱子上，按以上條件離心，棄濾液。

    9) 把柱套放回收集管中， 10,000xg 離心空柱 2min 以甩干柱子基質(zhì)。

    10) 把柱子裝在 1.5ml 離心管上，加入 30-100ul DEPC Water 柱子基質(zhì)上，室溫靜置 2min 。10,000xg 離心 1min 洗脫出 RNA 。

    11) RNA濃度測(cè)定

吸取lul抽提的RNA用DEPC水稀釋10倍后．在Nanodrop上測(cè)定RNA濃度，以DEPC水做空白對(duì)照，同時(shí)記錄RNA濃度及其OD260／OD280。

2. RNA電泳檢測(cè)

    1) 變性膠制備

取1gAgarose 75ml去離子水煮沸，冷卻至70℃左右加入10ml 10×Mops和15ml 甲醛及EB。倒膠至寬口梳子的膠板上，蓋上蓋子。

    2) 電泳緩沖液配制(1×Mops)

取50ml 10×Mops。用去離子水稀釋至500ml，倒入電泳槽中，再在電泳緩沖液中添加EB。

    3) RNA樣品處理

取RNA 樣品3u1．10×Mops 2u1．最后補(bǔ)充DEPC 水至20ul，65℃變性10min 后立即冷卻．加入2ul 10×RNA loadingbuffer即可電泳。

    4) RNA電冰

先把RNA 膠放入電泳槽中，100V 作用電泳約5min，再在點(diǎn)樣孔中點(diǎn)入處理過(guò)的RNA 樣品，100V左右電泳至溴酚藍(lán)至膠的2／3處，取膠拍照。

3. 反轉(zhuǎn)錄

    1)  融解反應(yīng)所需的試劑，上下輕微顛倒混勻，進(jìn)行短暫離心后放置冰上待用。

    2) RNA-Primer Mix的配制反應(yīng)（所有反應(yīng)液的配制都在冰上操作）在預(yù)冷的RNase free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積13μl。

試劑組分                               體積                        終濃度

Total RNA                                                               1μg

60μM Oligo（dT）18           1μL                           2.4μM

DEPC 水                                至總體積13μl

    3) RNA變性

混勻RNA-Primer Mix，進(jìn)行短暫離心，65℃變性10min后立即放置冰上。

    4) 配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液

在RNA-Primer Mix反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25μl。

試劑組分                             體積                終濃度

RNA-Primer Mix                 13μl

5×RT Reaction Buffer            5μl                 1×

25mM dNTP                          1μl                  1mM

25U/μl RNase Inhibitor         1μl                  1U/μl

200U/μl M-MLV RTase        1μl                  8U/μl

DEPC水                                 4μl

總體積                                  25μl

    5) 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

混勻反應(yīng)Mix，短暫離心后42℃孵育1h。

    6) 滅活并保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物

反應(yīng)結(jié)束后，85℃滅活處理5min，最后-20℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

4. 定量PCR實(shí)驗(yàn)

采用染料法（SYBR Green I）進(jìn)行相對(duì)定量分析，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是按照ΔΔCt解析法來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

    1) 將2XAllinOneTMQ—PCR Mix在室溫下融解．輕柔得上下顛倒混勻并進(jìn)行短暫離心。同時(shí)在使用過(guò)程中始終保持避光。

    2)  PCR reaction mix的制備 (在冰上操作)

試劑                                                用量                  終濃度

2XAllinOneTMQ—PCR Mix         10μl                   1×

ddH₂O                                              1μl

PCR Forward Primer（4μM）       2μl                     0.4μM

PCR Reverse Primer（4μM）        2μl                     0.4μM

cDNA                                               5μl

總體積                                            20μl

注意：在實(shí)驗(yàn)中也設(shè)計(jì)了NTC(No Template Control)，其為陰性對(duì)照，即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板cDNA，其它試劑不變．從而來(lái)質(zhì)控是否體系有污染。迅速將PCR reaction mix稍混勻，并加入8聯(lián)管中。

    3) 將8聯(lián)管進(jìn)行短暫離心，確保所有反應(yīng)液在反應(yīng)孔底部。

    4) PCR 反應(yīng)，采用了標(biāo)準(zhǔn)的三步法程序進(jìn)行反應(yīng)：

循環(huán)數(shù)           步驟              溫度               時(shí)間          檢測(cè)

1                     預(yù)變性           95℃              10min         Off

40                   變性               95℃              10sec          Off

退火               57℃              20sec              Off

延伸               72℃              15sec              On

    5) 在PCR 反應(yīng)后．采用以下的程序進(jìn)行熔解曲線分析

溫度              溫度間隔      時(shí)間           檢測(cè)

72℃~95℃    0.5℃             6sec/each    On

30℃                                    30sec           off