實(shí)驗(yàn)設(shè)備
SW-CJ-CO凈化工作臺(tái)[蘇州凈化設(shè)備有限公司]

FA1004A型電子天平[上海精天電子儀器廠]

70型離子純水器[上海亞榮生化儀器廠]

SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器[無(wú)錫科達(dá)儀器廠]

Mikro22R型高速冰凍離心機(jī)[Whatman Biometra]

5415D臺(tái)式離心機(jī)[Eppendorf]

SS-325型高壓滅菌器[Tomy Kogyo Co. Ltd]

YLE-2000數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋[上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠]

pHS-4C型酸度計(jì)[成都方舟科技開(kāi)發(fā)公司]

2002型振蕩器[常州國(guó)華電器有限公司]

旋渦混合器[北方同正生物技術(shù)發(fā)展公司]

梯度熱循環(huán)儀[Whatman biometra]

凝膠成像系統(tǒng)[上海四星生物技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司]

MDF-382E型超低溫保存箱[Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd]

DYY 12型電腦三恒多用電泳儀[北京六一儀器廠]

SmartSpecTM3000核酸濃度分析儀[BIO-RAD]

實(shí)驗(yàn)材料

三色書(shū)虱采自野外，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)建立種群。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 三色書(shū)虱總DNA的制備

   (1) 將50頭書(shū)虱置于1.5mL的離心管中，用研棒在液氮環(huán)境中迅速將試蟲(chóng)充分研碎后加入200µL DNA提取裂解液。

   (2) 加入2.5µL蛋白酶K溶液(20 mg/mL)，50℃水浴2h(或培養(yǎng)過(guò)夜)。

   (3) 用等體積的平衡酚( Tris-HC1飽和酚，pH7.8 )，溫和振蕩搖勻(約20 min )，置20℃下保存5-10 min。

   (4) 4℃下離心l0min，將粘稠的水相移至潔凈的離心管中。

   (5) 用等體積的酚:氯仿(1:1)，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿各抽提取一次，離心(9000 r/min 10 min)取上清液。

   (6) 加入0.2倍體積的乙酸鈉溶液(10 mol/L)和兩倍體積的無(wú)水乙醇，-20℃放置2h使DNA充分沉淀。

   (7) 離心(12000 r/min 10 min )，棄上清液，沉淀用70%乙醇(4℃)洗滌兩次。

   (8) 沉淀晾干(盡可能除去乙醇)后，將DNA重懸浮于TE緩沖液(pH8.0 )，于37℃中輕輕搖動(dòng)有利于DNA重懸浮，使DNA充分溶解。

   (9) 加入Rnase至終濃度為lµg/mL，37℃保溫lhr。

   (10) 按(4)~(9)抽提，沉淀，重懸DNA，在1µL雙蒸滅菌水或TE中，4℃保存。

   (11) 取DNA4µL與2µ1 6x加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣到1.4%瓊脂糖凝膠中，以2.5-5 v/cm電泳。

   (12)  0.5µg/mL的EB染色15-30min，紫外燈下觀察拍照。

制備的DNA濃度用SmartSpecTM3000核酸濃度分析儀檢測(cè)，要求先將比色杯用100µL/次的無(wú)菌水反復(fù)清洗再測(cè)水的吸光度，之后將DNA液稀釋50倍進(jìn)行檢測(cè)。要求OD=1.7左右。

2. 三色書(shū)虱體內(nèi)共生細(xì)菌Wolbachia的Long PCR檢測(cè)

Long PCR的20uL的反應(yīng)體系包括:

10 x buffer
 5 µL
 
25 mM MgCl2
 2 µL
 
10 mM dNTP
 0.7 µL
 
Pwo酶
 1 U
 
Taq DNA
 5 U
 
模板
 10 ng
 
10µM引物
 1.6 µL
 

wsp-F, 5'-TGG TCC AAT AAG TGA TGA AAG AAA CTA GCT A

wsp-R, 5'-AAAAAT TAAACG CTA CTC CAG CTT CTG CAC

用無(wú)菌水將反應(yīng)體系補(bǔ)充至20µL

擴(kuò)增條件為：94 ℃ 2min預(yù)變性后，94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin，10個(gè)循環(huán)；94℃ l0sec，65℃ 30sec，68℃ lmin。25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在68℃下延長(zhǎng)20sec。

擴(kuò)增結(jié)束后取5µL的PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(電壓5v/cm，電泳緩沖液為1 X TAE )，Bio-Rad凝膠成象系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

3. 序列的測(cè)定和分析