從 2013 年 1 月份開始到現(xiàn)在，近 2 年的時間里，CRISPR/Cas9 技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域被來自全球優(yōu)秀的科學(xué)家們不斷的擴大。其中包括基因敲除，定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位和 CHIP 等多個領(lǐng)域，而且這個技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域還在不斷的被擴大。

相比于其它重組技術(shù)，使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)做基因敲除是效率最高，成本最低的技術(shù)。其中的關(guān)鍵因素無異于下面幾點：

1) 明確需要敲除的基因序列

首先需要明確內(nèi)含子和外顯子序列；可以登錄 NCBI 或者 UCSC 的網(wǎng)站可以方便的查到；

2) 合適的靶位點選擇

一般建議設(shè)計 2-3 條，然后轉(zhuǎn)染到細胞中，用 Cruiser™ 和測序的方法驗證哪個靶位點的活性最好；也可以登錄 CRISPR/Cas9 敲除載體庫：（查看載體庫詳細頁） 看看是否有自己要研究的基因，這個載體庫中的靶位點都是在細胞體內(nèi)經(jīng)過活性驗證，保證敲除活性的；

3) 敲除載體選擇

根據(jù)需要可以選擇空載體，帶抗性的載體（Puro/Neo），帶熒光標記的載體（EGFP/RFP），雙敲除載體等。其中空載體較�。�8K），可以提高轉(zhuǎn)染的效率；抗性便于后面進行抗性篩選，熒光標記的載體便于進行流式分選；

4) 單細胞生長

不同的細胞單個細胞的生長情況不一樣。有的細胞長的快，有的細胞長的慢，有的單個細胞幾乎就不長。這個就需要采取不同的方案了，這里推薦一個單細胞培養(yǎng)的小耗材：Cell Plaza™。設(shè)計精巧，采用的是共培養(yǎng)的原理，如果碰到不好長的單個細胞，可以試一試。同時，這個對于植物細胞做敲除時的小愈傷的生長很有幫助。從事植物基因敲除方向的研究人員，也可以試一試；

 5) 陽性克隆篩選

除了敲除外，CRISPR/Cas9還可以應(yīng)用在定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位等各個方向，每個方向都有不同的細節(jié)需要把握。這里就不一一闡述，如果需要了解更多其它信息，可以隨時和我們聯(lián)系。也可關(guān)注吉銳生物官方微信（微信號：Genloci），參與互動。