這周我們來討論一項常用的技術，即使常用但仍引起部分人核酸分離焦慮癥。那就是基因組DNA的純化去雜質。

場景是這樣的：你有一份采自南太平洋中部一個偏僻小島上首次發(fā)現(xiàn)的古老蘭花品種根際土壤樣品。你使用了非PowerSoil Kit法提取其中的微生物DNA。最終DNA含有太多雜質，無法PCR擴增。因此需要去除腐植酸等。你需要所有的核酸分子通過全基因組鳥槍測序……怎么辦？

你致電MO BIO說了你的大概情況，而我們推薦了使用PowerClean Kit。PowerClean是不帶研磨珠套管的迷你版PowerSoil Kit。樣品經(jīng)過了IRT處理，重新洗脫得到干凈的DNA。等等…分光光度計讀數(shù)發(fā)生變化了！純化前顯示有300ng/μl的DNA，現(xiàn)在卻只有30ng/μl。有比這更可怕的噩夢嗎？你的DNA大量丟失了！

先別急�？梢愿嬖V你，你的DNA現(xiàn)在是安全并且干凈的。使用實驗室常規(guī)方法純化DNA前后到底發(fā)生什么事，下面向你解釋：

我想先回到之前寫的一篇關于的文章。這點非常關鍵，因為伴隨土壤、水樣、生物薄膜、植物組織等樣品一起被提取出來的有機抑制因子會影響波長260測量DNA得率讀數(shù)的準確性（也抑制PCR擴增）。如果采用CTAB法或苯酚氯仿法提取，降解的小分子RNA也會影響讀數(shù)。沒有使用抑制因子去除技術的硅膠離心柱型試劑盒、使用強力綁定鹽溶液無差別地綁定吸附DNA和RNA等因素同樣影響得率檢測數(shù)據(jù)。

好消息是，一旦這些影響因素被去除，最新的讀數(shù)才代表真正的得率

下面我們來看一下在實驗室常規(guī)檢測手段（分光光度法和瓊脂凝膠電泳）下DNA的情況是如何被展示的。我們從分光光度法開始，下面展示了幾個使用及未使用IRT技術提取的土壤樣品結果。首先注意到的是DNA得率讀數(shù)ng/ul。這個讀數(shù)很重要，但也只是告訴你事實的一小部分。。

縱覽整個表格

 

260/230比率告訴我們這個DNA有問題。讀數(shù)低于1.0，表示含有高水平的抑制因子。我們還能從320讀數(shù)中看到另一個重要的信息。與下列的樣品相比，上面的樣品讀數(shù)高出10倍。腐殖酸在波長320吸光度最強，因此340處的高吸光度值表示最終DNA中含有大量腐殖酸。260/230比值，加上較高的320吸光度，表明DNA很不干凈，且是由有機雜質引起的。

吸光光度法提供了所有波長下的數(shù)據(jù)。我們能清楚地看到在整個波段檢測中雜質的情況。讀數(shù)開始很高并持續(xù)放大。曲線的中部抑制因子集中的地方260讀數(shù)一直高于正常位置。

但是，這還是很難讓所有人相信，最終溶液中并不全是DNA。所以，最好的確認結果的辦法是瓊脂糖凝膠電泳。電泳圖中有分光光度法無法看到的信息，DNA的完整性和直觀的得率�，F(xiàn)在我們看到的情況完全不一樣。雖然分光光度法顯示未使用IRT技術的DNA得率是使用了IRT技術得率的兩倍，而電泳圖上它卻沒有跑出相應多的DNA。雜質干擾了分析結果。這就是為什么我們常常建議同時用分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳或picogreen檢測DNA。

那使用PowerClean Kit純化粗提DNA過程中發(fā)生了什么事？你去除DNA中的雜質成分，結果得率讀數(shù)下降了。有些時候讀數(shù)能下降多達50%。但大分子DNA并沒有損失。丟失的只是你不想要的雜質部分，討厭的PCR抑制因子浪費你的時間和金錢�，F(xiàn)在DNA總算干凈了。

讓我們再深入了解第二個誤導DNA得率的東東：RNA

許多提取方法會把RNA連同DNA一起提取出來。雖然這部分RNA分子并不完整，但仍會吸收UV。使用苯酚和氯仿提取核酸，以及等份強綁定鹽溶液、酒精吸附DNA法都會把RNA提出來。因為分光光度法并不能區(qū)分DNA和RNA。這就是為什么只檢測DNA部分的Picogreen法結果會更準確。瓊脂糖凝膠電泳能直觀地看到RNA彌散帶，對結果判斷更有幫助。

 

在這個例子中我們提取了過夜孵育的大腸桿菌純培養(yǎng)，每樣4ml。從電泳圖上能清晰看到底部彌散的降解RNA（條帶4-6）。分光光度法和Picogreen讀數(shù)對比結果列在了右邊。Picogreen的結果顯示，DNA的得率要比分光光度法讀數(shù)低60%。有些樣品RNA能推高讀數(shù)高達70%。如此大的誤差必定會對后續(xù)實驗結果產(chǎn)生影響。

好消息是，MOBIO的試劑盒設計上只綁定DNA，不吸附RNA。從上圖結果看來，確保了分光光度法讀書的準確性。根據(jù)需要，通過調整綁定條件還能增加或減少小片段核酸或RNA的捕捉效率。

所以，總結最后：做純化前后給DNA跑電泳。檢查濃度（得率）和完整新（DNA分子量大�。�，并與備用檢測方法（分光光度法或Picogreen）做對比檢查是否存在RNA或抑制因子。

開展后續(xù)實驗前對DNA樣品做個簡單的檢查可節(jié)省你的時間，減緩焦慮情緒。請記住，試劑盒只能你給什么，他們出什么。你要的是干凈的DNA。事先知道你有多少DNA，對最終出來的DNA有個大概估計，做到心中有數(shù)。