前面的文章我們介紹了如何提取土壤DNA。大篇幅詳細(xì)講解了影響DNA得率和純度的、（重點(diǎn)是裂解緩沖液）等問(wèn)題。做DNA遠(yuǎn)沒(méi)有做RNA壓力大。不用太擔(dān)心降解，得率還挺高。

提取土壤RNA是環(huán)境分子生物學(xué)研究最難的研究方法之一。RNA提取本身就是件艱巨的任務(wù)，提取土壤的RNA挑戰(zhàn)更大。最大的困難之一是土壤RNA得率。從土壤中獲得RNA遠(yuǎn)比DNA少，前者僅有后者的10-20%，所以需要比提DNA更多的加樣量。因此需要用更大的研磨管（15ml）和更大的離心機(jī)。

另一個(gè)大問(wèn)題是腐植酸等抑制因子的污染。RNA實(shí)驗(yàn)對(duì)純度要求很高，當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄尋找低拷貝數(shù)基因時(shí)，你無(wú)法稀釋RNA樣品。要求加入反應(yīng)體系中的RNA濃度足夠高且不能含有抑制因子。

提取土壤RNA需要特殊條件

因此，MO BIO開(kāi)發(fā)出了一套不使用二氧化硅離心柱的方法來(lái)提取土壤RNA。下面討論關(guān)于RNA PowerSoil Kit以及何如獲得更好的提取效果。

這套操作流程包含了多種方法。IRT技術(shù)去除抑制因子，酚氯仿法最充分地裂解微生物細(xì)胞，陰離子交換技術(shù)更高的純化質(zhì)量。最終獲得非常干凈的RNA最大化地滿足RT-PCR的需要。

讓我們一起來(lái)討論如何使用這些技術(shù)，并盡可能少出錯(cuò)返工。每個(gè)土壤樣品質(zhì)地、水分含量、微生物豐度都不一樣，在提取過(guò)程中出現(xiàn)的狀況不盡相同。下面我們重點(diǎn)討論幾個(gè)容易出錯(cuò)的關(guān)鍵步驟，以及做哪些修改可以獲得更好的提取效果。

1. 樣品起始量

對(duì)于絕大多數(shù)類型土壤，2g土壤是最大的樣品起始量。然而，對(duì)于底泥這類含水量較高的土壤，本身實(shí)際土壤含量較低，微生物含量也不高，我最多用到5g的起始量。如果樣品加入到研磨珠套管后，發(fā)現(xiàn)上面有一層水。最好先離心并吸去多余的水分。

2. 酚氯仿異戊醇Phenol: Chloroform（步驟3）:

使用正確的PCI非常重要，在試劑盒操作說(shuō)明書中我們給出了一些使用建議。PCI比例必須為25：24:1，pH介于6.7-8，并保存在pH8.0的TE緩沖液中。許多人提取動(dòng)物組織和細(xì)胞習(xí)慣性地只使用低pH值的苯酚來(lái)提取RNA。而對(duì)于土壤，pH中性的苯酚會(huì)合適。

3. 優(yōu)化異丙醇濃縮（步驟9）:

PCI裂解步驟后加入SR3溶液，下一步加入異丙醇沉淀總核酸。如果你在做底泥，加完SR3溶液后總體積可能超過(guò)5ml。增加SR4（異丙醇）的使用量，至與步驟8獲得的樣品體積相同，以保證充分沉淀核酸。

4. 異丙醇沉淀的環(huán)境溫度（步驟9）：

原有的操作說(shuō)明建議-20℃冷凍樣品。鹽濃度高的樣品核酸沉淀步驟請(qǐng)?jiān)谑覝叵逻M(jìn)行。冷凍樣品沉淀的鹽分，會(huì)改變陰離子交換離心柱上的核酸吸附綁定條件。你可以從沉淀物中看出來(lái)是否有鹽分沉淀。正常的RNA沉淀表面平坦有光澤，若沉淀明顯較大且表面有殼，表明有鹽分沉積。底泥樣品水分大，就算是淡水湖也好，多余的水分會(huì)含鹽。若你的土壤類型在-20℃下孵育能獲得更理想的得率，請(qǐng)按照原方法進(jìn)行。

暫停點(diǎn)：我曾經(jīng)把步驟9的孵育時(shí)間延長(zhǎng)超過(guò)30min，甚至過(guò)夜，最終RNA依然完好。我不建議每個(gè)樣品都延長(zhǎng)孵育時(shí)間，至少你的土樣樣品需要測(cè)試才能知道是否影響RNA質(zhì)量。只在特殊情況下，你可以稍微在此步驟暫停。

5. 陰離子交換離心柱溶液自然滴下（步驟14）

最后的RNA回收步驟使用的離心柱裝有樹(shù)脂，溶液利用重力通過(guò)離心柱。有時(shí)溶液通過(guò)樹(shù)脂的速度很慢，可適當(dāng)施加正壓加速流動(dòng)。通常我們的做法是用5ml注射器針管緩緩加壓，但流速不應(yīng)該超過(guò)1滴每秒。

6. 搖、搖，搖勻SR5和SR6（步驟12）：

SR5和SR6使用前必須充分搖勻。有些含有異丙醇的溶液靜置會(huì)分層，使用前只要充分搖勻即可。

7. 節(jié)省洗提時(shí)間小提示（步驟16-20）：

有時(shí)候我會(huì)直接洗脫到2ml Collection Tube，而不用15ml Tube。確保離心柱垂直放置不會(huì)傾覆。只有摸透了技巧才好這么弄，謝絕新手。

8. 最后異丙醇沉淀（步驟17）：Final isopropanol precipitation (step 20):

從離心管中洗脫下來(lái)以后，加入異丙醇（SR4溶液）做最終沉淀。需要在-20℃孵育。此步必須在-20℃孵育（VS 室溫）。此步可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

暫停點(diǎn)：若提取工作沒(méi)辦法繼續(xù)完成，可在此步暫停過(guò)夜。樣品在-20℃冷凍，RNA能穩(wěn)定保存。

9. 沉淀RNA（步驟18）：

離心異丙醇分離RNA，正常RNA沉淀應(yīng)小而呈玻璃光澤。離心時(shí)所有的Tube管要朝向一致，以便于倒出異丙醇時(shí)迅速辨認(rèn)RNA沉淀。晾干RNA沉淀步驟需要快速完成。通常我們的做法是在超凈臺(tái)中把Tube管倒置在吸水紙上。

10. 重懸RNA（步驟20）:

現(xiàn)在，你有了漂亮的干燥沉淀。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄對(duì)體積的要求，重懸RNA。在我們實(shí)驗(yàn)室里頭，若樣品土壤微生物非常豐富，我們會(huì)用50-100μl水重懸（通常最終濃度為100-20ng/μl）。底泥或干燥土壤微生物含量低，為了提高最終RNA濃度，我們用25μl水重懸。這一步可操作性很高，請(qǐng)根據(jù)你的需要加入適合的水量重懸沉淀。

額外提示：

用SR6溶液洗脫RNA以后，離心柱濾膜還有DNA在。你可以用含有高濃度鹽的SR8溶液（組分）把基因組DNA洗脫下來(lái)。因?yàn)檎麄�(gè)核酸提取過(guò)程動(dòng)作相對(duì)溫和，你可以獲得更大分子量的DNA。陰離子交換離心柱的又一優(yōu)勢(shì)在于，你可以從同一個(gè)樣品中先后提取到RNA和DNA。

再一個(gè)額外提示：RNA穩(wěn)定性和土樣保存：

我們常被問(wèn)到采樣后土樣中RNA的穩(wěn)定性，以及RNALater的使用。事實(shí)上RNALater并不兼容土壤。我們做過(guò)用RNALater在不同溫度和時(shí)間下對(duì)土壤RNA的保護(hù)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，RNALater會(huì)令土樣釋放出更多的腐植酸，粘附在RNA上與RNA共同吸附于陰離子交換離心柱濾膜上難以去除。保存的時(shí)間越長(zhǎng)，樣品顏色變得越深。

我們采樣時(shí)使用對(duì)土壤RNA進(jìn)行保護(hù)，并且在運(yùn)輸過(guò)程中能保證微生物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不變。

總結(jié)：

最具挑戰(zhàn)性的樣品提取就是土壤RNA。樣品中RNA非常不穩(wěn)定、含量很低，而且存在大量抑制因子和微生物源RNase。但是獲得高得率干凈RNA還是可以做到的。我希望以上十點(diǎn)小技巧能縮短你提取新土樣RNA的摸索過(guò)程。要是你有更多提取訣竅，不妨告訴我們。我們樂(lè)意聽(tīng)到研究者通過(guò)某些步驟特定的修改獲得他們想要的結(jié)果。

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