DNA合成（DNA synthesis ）技術(shù)介紹
蛋白質(zhì)概念提出：
DNA（DNA synthesis ）：按照預(yù)定核苷酸的順序，將脫氧核苷酸逐個(gè)進(jìn)行人工連接合成DNA鏈的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚體支持物上從3′端延伸核苷酸，可自動(dòng)化操作。)
目前，oligo DNA合成一般都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)，已在DNA化學(xué)合成中廣泛使用。DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從5’®3’方向延伸，而是由3’端開始。
具體的反應(yīng)步驟如下：
一、 保護(hù)基 (Deblocking): 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結(jié)在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。
二、活化 (Activation): 將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。
三、連接 (Coupling): 亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5’-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長一個(gè)堿基。
四、封閉 (Capping): 縮合反應(yīng)后，為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5’-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙�；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化 (Oxidation) :縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。
最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基 (一般對(duì)A、C堿基采用苯甲�；Ｗo(hù)；G堿基用異丁�；Ｗo(hù)；T堿基不必保護(hù)；亞磷酸用腈乙基保護(hù))、純化 (常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。
上述方法的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是極低的，其中含有大量的雜質(zhì)。主要雜質(zhì)有：所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長Oligo DNA含量僅為15%左右。盡管合成時(shí)每一步的效率都在97%~98%，但累積的效率并不高。以鏈長20mer和50mer為例，(97.5%)20»60%、(97.5%)50»28%�？梢娫诖之a(chǎn)品中目的Oligo DNA含量很低，甚至10%都不到。這些雜質(zhì)，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響下一步的反應(yīng)。因此必須對(duì)Oligo DNA進(jìn)行純化。
目前在DNA合成儀上合成的Oligo DNA主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法進(jìn)行純化。該方法純化的產(chǎn)品純度較高，可用于絕大部份的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。若考慮節(jié)約經(jīng)費(fèi)，對(duì)于要求較低的實(shí)驗(yàn)，如簡單的PCR反應(yīng)，則采用脫鹽純化即可。
Oligo DNA是以O(shè)D260值來計(jì)量的。在1ml的1cm光程標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿中，260nm波長下吸光度為1的Oligo溶液定義為1 OD260。雖然對(duì)于每種特定的寡核苷酸來說,其堿基的組成不盡相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量約為33mg，每個(gè)堿基的平均分子量約為330 Da。因此合成的Oligo DNA摩爾數(shù)可按以下公式近似計(jì)算：摩爾數(shù)(mmol) = [OD值´33]/[堿基數(shù)´330] = 0.1´[OD值/堿基數(shù)]
DNA（DNA synthesis ）：按照預(yù)定核苷酸的順序，將脫氧核苷酸逐個(gè)進(jìn)行人工連接合成DNA鏈的方法。目前多是采用固相合成法，即是在多聚體支持物上從3′端延伸核苷酸，可自動(dòng)化操作。)
目前，oligo DNA合成一般都采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速偶聯(lián)等優(yōu)點(diǎn)，已在DNA化學(xué)合成中廣泛使用。DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成過程從5’®3’方向延伸，而是由3’端開始。
具體的反應(yīng)步驟如下：
一、 保護(hù)基 (Deblocking): 用三氯乙酸 (Trichloroacetic Acid，TCA) 脫去連結(jié)在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT (二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)。
二、活化 (Activation): 將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體 (其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。
三、連接 (Coupling): 亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5’-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長一個(gè)堿基。
四、封閉 (Capping): 縮合反應(yīng)后，為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5’-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙酰化來封閉此端羥基，一般乙�；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化 (Oxidation) :縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到DNA片段粗品。
最后對(duì)其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基 (一般對(duì)A、C堿基采用苯甲�；Ｗo(hù)；G堿基用異丁�；Ｗo(hù)；T堿基不必保護(hù)；亞磷酸用腈乙基保護(hù))、純化 (常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。
上述方法的Oligo在脫去保護(hù)基后，目的Oligo純度是極低的，其中含有大量的雜質(zhì)。主要雜質(zhì)有：所脫下的保護(hù)基與氨形成的苯甲酸氨和異丁酸氨，腈磷基上脫下的腈乙基，以及合成時(shí)產(chǎn)生的短鏈等。以至于粗產(chǎn)品中全長Oligo DNA含量僅為15%左右。盡管合成時(shí)每一步的效率都在97%~98%，但累積的效率并不高。以鏈長20mer和50mer為例，(97.5%)20»60%、(97.5%)50»28%�？梢娫诖之a(chǎn)品中目的Oligo DNA含量很低，甚至10%都不到。這些雜質(zhì)，尤其是存在于粗產(chǎn)品中的大量鹽和短鏈，不但造成定量不準(zhǔn)，還會(huì)影響下一步的反應(yīng)。因此必須對(duì)Oligo DNA進(jìn)行純化。
目前在DNA合成儀上合成的Oligo DNA主要采用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)方法進(jìn)行純化。該方法純化的產(chǎn)品純度較高，可用于絕大部份的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。若考慮節(jié)約經(jīng)費(fèi)，對(duì)于要求較低的實(shí)驗(yàn)，如簡單的PCR反應(yīng)，則采用脫鹽純化即可。
Oligo DNA是以O(shè)D260值來計(jì)量的。在1ml的1cm光程標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿中，260nm波長下吸光度為1的Oligo溶液定義為1 OD260。雖然對(duì)于每種特定的寡核苷酸來說,其堿基的組成不盡相同，但1 OD260 Oligo DNA的重量約為33mg，每個(gè)堿基的平均分子量約為330 Da。因此合成的Oligo DNA摩爾數(shù)可按以下公式近似計(jì)算：摩爾數(shù)(mmol) = [OD值´33]/[堿基數(shù)´330] = 0.1´[OD值/堿基數(shù)]
標(biāo)簽：
多肽合成 DNA
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