血清替代品：XerumFree XF205培養(yǎng)基添加物使用說(shuō)明書(shū)
血清替代品：XerumFreeTM XF205 培養(yǎng)基添加物使用說(shuō)明書(shū)
以下翻譯僅供參考！最終使用者請(qǐng)參看英文原文說(shuō)明書(shū)。
使細(xì)胞能在無(wú)血清環(huán)境中生長(zhǎng)
確保無(wú)動(dòng)物成分且經(jīng)過(guò)GMP認(rèn)證的細(xì)胞培養(yǎng)添加物
細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)具有一定的挑戰(zhàn)性。這篇文章的目的是指導(dǎo)終端使用者平穩(wěn)過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境中，且避免所有不足的或不恰當(dāng)?shù)呐Α?/div>
理想的過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境下應(yīng)該經(jīng)歷幾個(gè)階段，逐漸地篩選使細(xì)胞生長(zhǎng)在無(wú)血清環(huán)境下。然而，如果所有關(guān)鍵步驟都能很好的解決，直接過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境下也有可能會(huì)成功。
無(wú)論使用什么方法，關(guān)鍵點(diǎn)包括細(xì)胞接種的生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞接種密度，繼代培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞培養(yǎng)體系的生物物理屬性。
TNCbio’s XerumFreeTM血清替代品已經(jīng)作為一種培養(yǎng)基添加物使用，使用方法跟傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)血清一樣。然而濃度是5倍濃縮液，因此你可以添加2%濃縮液到常規(guī)培養(yǎng)基中，操作步驟跟平常一樣。
內(nèi)容
使用前重點(diǎn)注意事項(xiàng)
1 制備
1.1 常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)基的制備
1.2 過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境下的常規(guī)調(diào)整方法
1.2.1 直接過(guò)渡
1.2.2 后續(xù)調(diào)整
2 XF205的使用
2.1 細(xì)胞系
2.1.1 貼壁依賴型細(xì)胞系
2.1.2 貼壁非依賴型細(xì)胞系
2.2 干細(xì)胞
2.2.1 準(zhǔn)備步驟—包被
2.2.2 hESCs和hiPSCs的培養(yǎng)
2.2.3 MSCs的培養(yǎng)
2.3 原代細(xì)胞培養(yǎng)
2.3.1 普通建議
2.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)的具體建議
2.3.3 推薦的體系
使用濃縮的XerumFreeTM XF205之前的重點(diǎn)注意事項(xiàng)：
--XF205是一種替代血清的細(xì)胞培養(yǎng)基附加物，并不是最終的培養(yǎng)基。
--XF205必須和基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基一起使用（比如IMDM, DMEM-F12或其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基）。
--無(wú)需對(duì)XerumFreeTM XF205或加了XerumFreeTM后的培養(yǎng)基過(guò)濾處理。
--如果需要，先濾滅培養(yǎng)基，然后在無(wú)菌條件下添加XerumFreeTM XF205到濾滅的培養(yǎng)基中。
--相比于血清， XF205是5倍濃縮液，因此使用同等的量的話（比如2% XF205替代10% FBS）。
--XF205不含有生長(zhǎng)因子如細(xì)胞因子，激素等，因此也不含有胰島素。
1 制備
1.1 無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的普通制備方法
使用之前輕輕地、短暫地?fù)u晃XerumFreeTM瓶。
添加5倍濃縮的XerumFreeTM到你的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中（如10% FBS相當(dāng)于2% XF205）。
不要濾滅XerumFreeTM或不要濾滅添加完XerumFreeTM后的培養(yǎng)基（XF 205是無(wú)菌的）。
如果培養(yǎng)基需要濾滅，則需在添加X(jué)F之前濾滅。
在這個(gè)階段不要添加抗生素，實(shí)際上，抗生素像其它許多化合物一樣會(huì)結(jié)合到血清的漿蛋白上，尤其是結(jié)合到白蛋白片段上。因此在無(wú)血清和白蛋白條件下同樣濃度的抗生素將顯示出較高的生物活性，且這種增加的活性對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能產(chǎn)生有害的影響。
以防無(wú)抗生素培養(yǎng)不可行，建議添加50mg/L的慶大霉素到培養(yǎng)基中。
*一些使用者喜歡或需要在無(wú)胰島素條件下培養(yǎng)細(xì)胞，如果您使用XerumFreeTM培養(yǎng)細(xì)胞，您可以選擇添加或不添加胰島素或其它的生長(zhǎng)因子來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。如果需要添加胰島素促進(jìn)細(xì)胞增殖或性能研究，我們建議添加終濃度為1.25mg/L重組胰島素到細(xì)胞培養(yǎng)基中。
1.2 過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境中的常規(guī)方法
通常有兩種方法使細(xì)胞過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境下生長(zhǎng)。
1.2.1 直接過(guò)渡
直接把細(xì)胞從含有血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基中。
1.2.2 逐漸適應(yīng)法
按照以下步驟逐步地把細(xì)胞從含有血清的培養(yǎng)基中過(guò)渡到無(wú)血清培養(yǎng)基中，每一步把含有血清的培養(yǎng)基減半，因此按照下面的比例值來(lái)添加無(wú)血清培養(yǎng)基：
階段1：50% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 50% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段2：75% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 25% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段3：87.5% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 12.5% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段4：93.75% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 6.25% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段5：96.88% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 3.12% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段6：98.44% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基 / 1.56% Serum-supplemented 培養(yǎng)基
階段7：100% XerumFree-supplemented 培養(yǎng)基
按照以上步驟如果細(xì)胞生長(zhǎng)不好，則返回一步，細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)正常再繼續(xù)下面的階段。
細(xì)胞培養(yǎng)物可能由不同的細(xì)胞系構(gòu)成（貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞）或原代細(xì)胞培養(yǎng)物。然而，從功能角度來(lái)看，干細(xì)胞制備過(guò)程中細(xì)胞類(lèi)型可能分化為不同的程度或顯示出未分化特性。在不同情況下，為了保證我們培養(yǎng)的細(xì)胞獲得最大的成功，我們要考慮到不同的細(xì)胞類(lèi)型有不同的要求，需要不同的過(guò)渡方法。
基于此原因我們把過(guò)渡程序分為三部分，對(duì)應(yīng)于三種細(xì)胞分別為：
2.1 –細(xì)胞系
2.2 –干細(xì)胞
2.3 –原代細(xì)胞
2.1 細(xì)胞系
以下操作流程對(duì)于常規(guī)（二倍體細(xì)胞，有限細(xì)胞系）或轉(zhuǎn)化的或永生細(xì)胞系（無(wú)限細(xì)胞系）是有效的。
2.1.1 貼壁依賴性細(xì)胞系
關(guān)鍵成功因素：
--理想的細(xì)胞貼壁包被物
--最小化胰蛋白酶作用
--抗生素體系的選擇
實(shí)驗(yàn)步驟
A） 用足夠的細(xì)胞貼壁因子包被細(xì)胞培養(yǎng)容器表面。
--一些商用的包被試劑如PronectinTM F, MapTRIXTM或同等的其它產(chǎn)品
--纖連蛋白或多聚賴氨酸或其它
--少量FBS(如對(duì)于T25燒瓶添加500ul) 37℃孵育過(guò)夜，隨后用新鮮培養(yǎng)基或PBS洗兩遍。
--利于細(xì)胞貼壁的一種即用型塑料器皿。
B）解離細(xì)胞成單層細(xì)胞
--在無(wú)血清條件下使用標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶可能不太可行，因?yàn)檠逯泻幸鹊鞍酌敢种苿�。因此為了避免�?duì)細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷，在無(wú)血清條件下，最小化殘留胰蛋白酶水解活性是非常重要的。為達(dá)到最佳效果，可使用胰蛋白酶抑制劑（比如來(lái)源于大豆）或用無(wú)哺乳動(dòng)物源的分散劑如Accutase™，且Accutase™在傳代過(guò)程無(wú)需進(jìn)行失活處理或去除。另外也可以通過(guò)洗細(xì)胞的方法來(lái)去除大部分殘留的胰蛋白酶。然而這個(gè)方法需要額外的離心步驟，而離心對(duì)于某些細(xì)胞類(lèi)型可能有損傷。
--優(yōu)先選擇：不使用胰蛋白酶，使用Accutase™ 或 Detachin™分散細(xì)胞為單層細(xì)胞；這些細(xì)胞分散液已經(jīng)能夠滿足溫和，有效的分散貼壁細(xì)胞的要求；將不會(huì)損傷細(xì)胞膜和表面表位并且能夠保持蛋白表面的結(jié)構(gòu)和功能性能完整。
C）細(xì)胞以20000/cm2的密度接種到按照Point 1所制備的完全培養(yǎng)基中。
在從血清培養(yǎng)基到無(wú)血清培養(yǎng)基適應(yīng)過(guò)程的第一步中觀察高接種密度的狀態(tài)是重要的。細(xì)胞一般可分泌大量調(diào)控細(xì)胞貼壁、生長(zhǎng)和增殖的因子到培養(yǎng)基中。然而，在剛接種時(shí)新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基中是不含這些因子的，因此為了及時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的自分泌/旁分泌因子，接種時(shí)達(dá)到細(xì)胞密度的臨界值是至關(guān)重要的。
D）孵育并維持細(xì)胞在37℃中培養(yǎng)直至達(dá)到80-90%的匯合。
在這個(gè)階段每2-3天換75%培養(yǎng)基。不要丟棄用過(guò)的培養(yǎng)基，而把它們收集起來(lái)，濾滅并保存于4℃為下一步使用。如果細(xì)胞在任何點(diǎn)看起來(lái)是停止?fàn)顟B(tài)的，那么給更多的時(shí)間讓細(xì)胞去適應(yīng)新的無(wú)血清環(huán)境。
E）當(dāng)接近匯合率時(shí)，以1：2或1：3的比例分開(kāi)細(xì)胞。
對(duì)于XerumFreeTM的第二個(gè)階段，包被是不需要的，強(qiáng)烈建議使用上一步用過(guò)的培養(yǎng)基，因?yàn)槔锩婧姓{(diào)控細(xì)胞貼壁，蔓延，生長(zhǎng)和增殖的自分泌因子。在含有75%的新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基+25%用過(guò)的培養(yǎng)基（上一步收集起來(lái)的）接種細(xì)胞。繼續(xù)每2-3天用75%新鮮培養(yǎng)基更換，以供給細(xì)胞，且按照d）步驟繼續(xù)收集用過(guò)的培養(yǎng)基。
F) 重復(fù)E）步驟，與之前在含有血清的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況相比，直到細(xì)胞顯示出類(lèi)似生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。這個(gè)時(shí)候可以認(rèn)為細(xì)胞系完全適應(yīng)了無(wú)血清條件培養(yǎng)，這可能需要4-6個(gè)階段。
G) 從這個(gè)階段開(kāi)始，培養(yǎng)基中可能需要加抗生素。我們建議用廣譜性抗生素慶大霉素；與標(biāo)準(zhǔn)的青霉素/鏈霉素溶液相比，慶大霉素有較低的毒性，慶大霉素建議的使用濃度是：50mg/L。
H）一旦細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，就應(yīng)使用原始的分配比例（在含有血清的培養(yǎng)條件下）。
2.1 細(xì)胞系
2.1.2 貼壁非依賴性細(xì)胞系
以下操作流程適用于生長(zhǎng)在懸浮液中的細(xì)胞系。對(duì)于貼壁細(xì)胞過(guò)渡到無(wú)血清環(huán)境中懸浮生長(zhǎng)，請(qǐng)參照TNC BIO’s 技術(shù)說(shuō)明“細(xì)胞從單層到無(wú)血清環(huán)境懸浮培養(yǎng)的適應(yīng)過(guò)程”。
關(guān)鍵成功因素：
抗生素體系的選擇
實(shí)驗(yàn)步驟
A） 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到3-5×106細(xì)胞/ml（依賴于細(xì)胞系），開(kāi)始轉(zhuǎn)換到XerumFreeTM添加的培養(yǎng)基中。收集細(xì)胞懸浮液，取出少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并對(duì)整個(gè)懸浮液以200g的離心力離心5分鐘。
B） 完成細(xì)胞計(jì)數(shù)
C） 在添加X(jué)erumFreeTM的培養(yǎng)基中細(xì)胞密度為106細(xì)胞/ml時(shí)，重懸細(xì)胞顆粒。
在過(guò)渡過(guò)程的第一個(gè)步驟觀察高的細(xì)胞接種密度是非常重要的。然而，在接種步驟中，新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基中是不含這些因子的，因此為了及時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生足夠的自分泌/旁分泌因子，接種時(shí)達(dá)到細(xì)胞密度的臨界值是至關(guān)重要的。
D） 在37℃中孵育細(xì)胞培養(yǎng)物直到細(xì)胞密度達(dá)到大約3-5×106細(xì)胞/ml。
E）通過(guò)添加適當(dāng)體積的新鮮培養(yǎng)基，以1：3或1：4的比例分開(kāi)懸浮培養(yǎng)物（比如25ml細(xì)胞懸浮液+75ml 含有XerumFreeTM的培養(yǎng)基，分到四個(gè)單獨(dú)的培養(yǎng)瓶中）
F）重復(fù)E）步驟直到培養(yǎng)物顯示出像在原來(lái)含有血清的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)。從那時(shí)起，細(xì)胞系已經(jīng)完全適應(yīng)并可按照含有血清的培養(yǎng)基中的原始比例。
G）從這個(gè)階段開(kāi)始，培養(yǎng)基中開(kāi)始加入抗生素。
我們建議使用濃度為50mg/L慶大霉素，與標(biāo)準(zhǔn)的青霉素/鏈霉素溶液相比，慶大霉素有較低的毒性。
2.2 干細(xì)胞
2.2.1 準(zhǔn)備步驟—培養(yǎng)器皿表面的包被
如果培養(yǎng)的是人多能干細(xì)胞（hPSCs）或多潛能間充質(zhì)/基質(zhì)細(xì)胞，那么用足夠的包被劑處理培養(yǎng)器皿表面是至關(guān)重要的，我們一般使用的是制備較粗糙的胞外基質(zhì)，比如MatrigelTM。
然而，這些包被劑里含有一些不明確的成分比如小鼠腫瘤源的物質(zhì)和動(dòng)物源的成分存在等。
如果需要使用包被劑，我們推薦使用StemAdhreTM，因其是一個(gè)明確的基質(zhì)，只含有一個(gè)由純粹的人的序列組成的重組蛋白，因此可視為無(wú)動(dòng)物成分（ACF），然而，并不是所有的組織培養(yǎng)板都能用StemAdhreTM Defined Matrix來(lái)包被。
第三種來(lái)自Corning 的feeder free，xeno free且化學(xué)成分明確的包被劑 SynthemaxTM Surface，這個(gè)產(chǎn)品為模仿細(xì)胞的天然環(huán)境而設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)特殊處理、即用型包被塑料器皿，經(jīng)驗(yàn)證一些hESC和hiPSC細(xì)胞系已取得很好的結(jié)果。在初始的過(guò)渡期轉(zhuǎn)換到SynthemaxTM可能需要注意，但幾個(gè)階段后細(xì)胞又會(huì)恢復(fù)良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。
在血清替代品的使用說(shuō)明中不包括MatrigelTM和StemAdhreTM的包被操作步驟。
關(guān)于SynthemaxTM包被塑料器皿的的詳細(xì)信息請(qǐng)登錄：
重點(diǎn)注意事項(xiàng)：
--XerumFreeTM不含任何的生長(zhǎng)因子，因此也不含有bFGF和胰島素。培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)我們建議添加bFGF或胰島素或IGF。
--XerumFreeTM不含硒，培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)我們建議用含有硒的培養(yǎng)基。
2.2.2 hESCs 和hiPSCs的無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)
按照上面的包被步驟在含有2-3%的XerumFreeTM的DEME/F-12培養(yǎng)基里培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
外部的和自分泌的信號(hào)的作用是基質(zhì)重塑和維持胚胎干細(xì)胞的更新（Przybyla, L.M. and Voldman J. PNAS vol. 109 no. 3, 835-840, 2012）。基于此，為了不耗盡這些重要因子，按照下面的描述改變操作步驟使其粘附在培養(yǎng)基中極其重要。
hESCs和hiPSCs完全培養(yǎng)基的制備
--使用常規(guī)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（比如DMEM-F12）
--添加濃度為2 mM的L-谷氨酰胺到培養(yǎng)基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到終體積為100ml的培養(yǎng)基中）
--添加bFGF使終濃度為4 ng/ml（比如母液為10 ug/ml吸取40ul到終體積為100ml的培養(yǎng)基中）
--添加2-巰基乙醇使終濃度為0.1mM（比如母液為55mM吸取182ul到100ml培養(yǎng)基中）
--如果使用抗生素保護(hù)體系，我們建議使用濃度為50mg/ml的慶大霉素。
--因?yàn)閄erumFreeTM不含胰島素，你可以添加（重組）胰島素或IGF到培養(yǎng)基中
--如果必要可以濾滅培養(yǎng)基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
含有XerumFreeTM的培養(yǎng)基中培養(yǎng)hESCs—第一階段
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被6孔培養(yǎng)板或用SynthemaxTM培養(yǎng)器皿。
--融化一瓶新鮮的hESC或從現(xiàn)有的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移hESC細(xì)胞（從飼養(yǎng)層或無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系），用膠原酶或其它更好的方法處理，像平常一樣使用Accutas和sediment，Accutas是非動(dòng)物源的且具有蛋白酶和膠原酶活性，在hESC細(xì)胞的培養(yǎng)中已顯示出顯著的效果。
--用MatrigelTM或StemAdhreTM包被培養(yǎng)板：吸取過(guò)量的Matrigel或StemAdhre包被試劑
--SynthemaxTM培養(yǎng)板：無(wú)需處理，即可使用
--置細(xì)胞于按照以上步驟制備的完全培養(yǎng)基中
--通過(guò)連續(xù)7天每天更換75%的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，余留25%的含有細(xì)胞的自分泌因子的培養(yǎng)基是非常重要的。
注意：與MEFs相比，細(xì)胞在MatrigelTM包被的板子上生長(zhǎng)的更好且密度更高，且不失其形態(tài)學(xué)特征
細(xì)胞培養(yǎng)的傳代
--用DPBS洗細(xì)胞一次
--添加分散酶（比如在DMEM-F12培養(yǎng)基中每孔添加1ml濃度為2mg/ml的酶溶液）并在37℃中孵育
--通過(guò)輕輕地拍打培養(yǎng)板的一側(cè)在10-15 min內(nèi)分散細(xì)胞
注意：勿刮細(xì)胞
--把含有細(xì)胞的分散后的溶液轉(zhuǎn)移到一個(gè)滅菌的15ml管中，為了收集盡可能多的細(xì)胞，再用每孔1ml的生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗培養(yǎng)孔。
--離心并洗兩次
--用吸頭輕輕地吹打細(xì)胞，這樣可使細(xì)胞在分散酶中輕易地分散開(kāi)。
注意：體積較小的細(xì)胞和單個(gè)細(xì)胞不能很好地存活。
--以正常的比例包被培養(yǎng)板（Matrigel, StemAdhere, Synthemax-請(qǐng)參看上面的說(shuō)明）
2.2.3 MSCs的培養(yǎng)
下面操作規(guī)程是在明確地環(huán)境中培養(yǎng)MSCs，可以是從液氮中保存的冰凍的細(xì)胞系或在不同的細(xì)胞培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)的培養(yǎng)物。
一般考慮
--如果MSCs細(xì)胞沒(méi)有及時(shí)接種應(yīng)保存在液氮中，過(guò)高的溫度（-80℃）將對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷。
--使用無(wú)菌操作技術(shù)且在超凈工作臺(tái)里操作
--37℃，5% CO2孵育箱內(nèi)濕潤(rùn)孵育細(xì)胞
--培養(yǎng)器皿必須按照在使用說(shuō)明B部分的準(zhǔn)備步驟關(guān)于“培養(yǎng)表面的包被”的說(shuō)明來(lái)處理
--細(xì)胞接種密度以2000 /cm2，避免生長(zhǎng)的細(xì)胞融合，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到大約70%時(shí)繼代一次
--使用無(wú)需經(jīng)血清失活的消化酶，比如AccutaseTM
--收集之后，輕輕地吸吐細(xì)胞使其重懸，不要旋渦細(xì)胞
--按照下面的描述準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中所用到的所有材料和設(shè)備
--預(yù)熱所有與細(xì)胞接觸的溶液和培養(yǎng)基
完全培養(yǎng)基的制備
--你可以用你常規(guī)使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基
--添加濃度為2 mM的L-谷氨酰胺到培養(yǎng)基中（比如吸取200 mM的母液1.0ml到終體積為100ml的培養(yǎng)基中）
--添加bFGF使終濃度為4 ng/ml（比如母液為10 pg/ml吸取40pl到終體積為100ml的培養(yǎng)基中）
--如果使用抗生素保護(hù)體系，我們建議使用濃度為50mg/L的慶大霉素。
--因?yàn)閄erumFreeTM不含胰島素，你可以添加（重組）胰島素或IGF到培養(yǎng)基中
--如果必要可以濾滅培養(yǎng)基
--添加2% 的XerumFreeTM XF205
解凍細(xì)胞
在解凍過(guò)程中，必須要小心地輕輕地處理細(xì)胞，且立即放入預(yù)熱的完全培養(yǎng)基中。
--在15ml的錐形離心管里放入10ml預(yù)熱的完全培養(yǎng)基
--把細(xì)胞從液氮中轉(zhuǎn)移出來(lái)
--把盛有細(xì)胞的錐形瓶放入37℃水浴中并輕輕地?cái)嚢柚敝了械谋诨?/div>
--立即用70%乙醇消毒錐形瓶
--立即把細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有預(yù)熱培養(yǎng)基的錐形瓶以300×g離心5min
--吸取上清液并小心地在完全培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞
--以2000-4000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞密度接種在由MatrigelTM或StemAdhereTM包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，或即用型SynthemaxTM培養(yǎng)皿（Greiner）
--在37℃，5% CO2的濕潤(rùn)孵育器中孵育細(xì)胞
--每天通過(guò)更換75%培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，余留25%含有細(xì)胞自分泌因子的培養(yǎng)基是非常重要的。
當(dāng)達(dá)到大約70%的融合時(shí)繼代細(xì)胞培養(yǎng)
細(xì)胞的繼代
--吸取細(xì)胞培養(yǎng)基，用DPBS(無(wú)Ca++/Mg++)洗細(xì)胞一次。
--用足夠體積的AccutaseTM溶液浸沒(méi)細(xì)胞層并在37℃孵育5min。如必要可通過(guò)輕輕地拍打細(xì)胞培養(yǎng)器皿的側(cè)面分散細(xì)胞。
--加入完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞消化溶液（至少加兩倍體積的AccutaseTM）
--轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸浮液到離心管中，然后以300×g離心5min
--棄上清然后在完全培養(yǎng)基中通過(guò)輕輕地吸吐重懸細(xì)胞
--細(xì)胞計(jì)數(shù)
--以2000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種細(xì)胞懸浮液到一個(gè)新的包被的培養(yǎng)板中或即用型SynthemaxTM培養(yǎng)皿中（參看上面“培養(yǎng)器皿表面的包被”）
--在37℃，5% CO2的濕潤(rùn)孵育器中孵育細(xì)胞
--當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到近70%時(shí)盡快地進(jìn)行繼代培養(yǎng)，一般情況下每周繼代兩次。
2.3 原代培養(yǎng)
原代細(xì)胞培養(yǎng)物存在于剛剛從活的組織或器官分離而來(lái)的生長(zhǎng)的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表著細(xì)胞培養(yǎng)世界的核心：到目前為止所有的細(xì)胞系都起始于原代培養(yǎng)。除了產(chǎn)生新的細(xì)胞系，原代培養(yǎng)代表著一個(gè)非常重要的工具，尤其在藥物發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)，再生醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域里。
從技術(shù)角度來(lái)看，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中原代細(xì)胞培養(yǎng)仍然是最微妙的一部分。新分離的細(xì)胞沒(méi)有任何選擇壓力且高度保留著體內(nèi)部分的特征。這就要滿足新分離細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)和生理的要求。在理想地情況下，對(duì)于原代細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)盡可能地模仿體內(nèi)的環(huán)境，比如細(xì)胞外空間。只在明確的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，且對(duì)營(yíng)養(yǎng)和細(xì)胞因子的供給完全地控制才能夠?qū)崿F(xiàn)這一理想情況。
原代細(xì)胞培養(yǎng)有著非常不同的要求，取決于組織的來(lái)源。在無(wú)不明確的添加物比如牛血清或其衍生物的條件下，已經(jīng)證明XerumFreeTM在不同的原代細(xì)胞培養(yǎng)中取得成功。然而，沒(méi)有一個(gè)通用的能滿足所有原代細(xì)胞類(lèi)型培養(yǎng)的配方。
下面的指導(dǎo)方針?lè)譃閮刹糠郑簯?yīng)用于所有細(xì)胞類(lèi)型的常規(guī)建議和主要組織類(lèi)型的具體要求。
2.3.1 常規(guī)建議
無(wú)論所用的是哪種細(xì)胞類(lèi)型，如果選擇無(wú)血清條件下進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，需按照以下幾點(diǎn)進(jìn)行處理。
無(wú)血清貼壁因子
準(zhǔn)備步驟--培養(yǎng)器皿表面的包被
在明確的培養(yǎng)條件下，用足夠的包被劑處理培養(yǎng)表面是至關(guān)重要的。通常細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的制備較粗糙，比如小鼠肉瘤提取物（比如基質(zhì)膠）或提取的膠原。然而，不明確的天然成分和動(dòng)物源成分的存在顯示許多應(yīng)用是有問(wèn)題的。
如果不想培養(yǎng)基中含有的動(dòng)物源成分造成任何問(wèn)題，快速的解決方法可以考慮用已采用少量FBS過(guò)夜處理的細(xì)胞培養(yǎng)板。這個(gè)方法是方便經(jīng)濟(jì)有效的，然而它將意味著從完全明確的培養(yǎng)環(huán)境的概念中后退一步。
今天可以用現(xiàn)成的重組的，明確的包被試劑盒，盡管是來(lái)源于纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原蛋白，E-鈣粘蛋白，玻連蛋白等生物合成的信號(hào)肽，但能模仿ECM蛋白的貼壁性質(zhì)。
無(wú)血清酶抑制劑
消化酶
開(kāi)始一個(gè)原代培養(yǎng)主要有兩種方法：通過(guò)從組織塊中分離或酶解離而來(lái)的產(chǎn)物。在后一種方法中起始組織用蛋白水解酶或酶溶液消化，比如分散酶，膠原酶和胰蛋白酶。
接種細(xì)胞之前必須小心地中和/失活任何有蛋白水解活性的成分。尤其是使用胰酶時(shí)必須解決這個(gè)問(wèn)題。
無(wú)血清的環(huán)境中使用標(biāo)準(zhǔn)胰酶制備可能會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，因?yàn)檠逯泻幸鹊鞍酌敢种苿�。分散�?xì)胞之后，在無(wú)血清條件下胰酶活性必須被失活，可以用一個(gè)高效的胰酶抑制劑，比如大豆胰酶抑制劑。
作為胰酶的替代品，強(qiáng)烈建議使用AccutaseTM，因?yàn)槠洳恍枰皇Щ睢＿@個(gè)重組的非哺乳動(dòng)物來(lái)源的酶已經(jīng)高效地應(yīng)用于一系列原代細(xì)胞培養(yǎng)中，包括原代平滑肌細(xì)胞，原代人內(nèi)皮細(xì)胞，原代雞神經(jīng)細(xì)胞。
無(wú)血清蛋白的結(jié)合
抗生素的使用
像其它化合物一樣抗生素結(jié)合到血清的血漿蛋白上，尤其是白蛋白片段。因此，在無(wú)血清和白蛋白的條件下同樣的抗生素濃度將顯示出較高的生物活性，且增加的活性將對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)造成有害影響。尤其是鏈霉素會(huì)干擾哺乳動(dòng)物細(xì)胞蛋白合成水平。
如果無(wú)抗生素培養(yǎng)是不可行的，我們建議使用濃度為50mg/L的慶大霉素。
2.3.2. 針對(duì)細(xì)胞類(lèi)型的具體建議
根據(jù)組織來(lái)源不同，原代細(xì)胞培養(yǎng)有不同的細(xì)胞培養(yǎng)要求。
在這個(gè)冊(cè)子里我們沒(méi)有具體描述原代細(xì)胞培養(yǎng)操作流程，因?yàn)椴煌募?xì)胞類(lèi)型之間是截然不同的。一般情況下我們建議用傳統(tǒng)的方法分離原代細(xì)胞，并且用5倍濃縮的XerumFreeTM代替血清。
這將滿足大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型的營(yíng)養(yǎng)需求，事實(shí)上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)這個(gè)領(lǐng)域，營(yíng)養(yǎng)需求稍有不同，更多地依賴于細(xì)胞類(lèi)型，比如肝細(xì)胞需要更高的營(yíng)養(yǎng)濃度。
不同類(lèi)型的細(xì)胞之間對(duì)生長(zhǎng)因子和激素的需求是不同的。
下面的表格列出了我們推薦用XerumFreeTM代替動(dòng)物血清的細(xì)胞培養(yǎng)基制備。
關(guān)于指定的四種細(xì)胞類(lèi)型，生長(zhǎng)因子和激素的添加對(duì)于細(xì)胞發(fā)育和增殖是理想的。
2.3.3推薦的四種主要的原代細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)基的建立
| 原代細(xì)胞培養(yǎng)類(lèi)型 |
推薦 |
終濃度 |
要求 |
|
|
生長(zhǎng)因子 |
激素 |
|||
| 原代腎細(xì)胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
重組人胰島素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | |
| 皮質(zhì)醇 | 0.1 ug/ml | 必需的 | ||
| 腎上腺素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 三碘-L-甲腺原氨酸 | 10 pg/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 10 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代肝細(xì)胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2-3% |
重組人胰島素 | 5 ug/ml | 必需的 | |
| 皮質(zhì)醇 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代角質(zhì)細(xì)胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
牛垂體提取物（BPE） | 4 ul/ml | 必需的 | |
| 皮質(zhì)醇 | 5 ug/ml | 必需的 | ||
| 腎上腺素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 0.125 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 原代心肌細(xì)胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
T3（三碘-L-甲腺原氨酸） | 1ng/ml（1.5nM） | 必需的 | |
| 重組人胰島素 | 5 ug/ml | 必需的 | ||
| 重組人EGF | 5 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 重組人bEGF | 5 ng/ml | 理想的/有益的 | ||
| 神經(jīng)元細(xì)胞 | ||||
|
XerumFreeTM XF205 2% |
重組人EGF | 50 ng/ml | 理想的/有益的 | |
| 重組人胰島素 | 0.5 ug/ml | 必需的 | ||
*為了使細(xì)胞很好地貼壁和蔓延，我們強(qiáng)烈建議用CaCl2(0.06 mM)
Nb. 不要濾滅XerumFreeTM。我們建議制備含有谷氨酰胺的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如果生長(zhǎng)因子和激素需要濾滅，可以濾滅之后再添加X(jué)erumFreeTM。
Nb. XerumFreeTM是5倍濃縮的，因此所加的5倍濃縮液比通常所用的FBS體積低（比如10% FBS相當(dāng)于2% XerumFreeTM）。
Nb. 對(duì)于其它的原代培養(yǎng)細(xì)胞類(lèi)型，可以聯(lián)系TNC Bio，關(guān)于建議生長(zhǎng)因子和激素的添加量，我們將盡可能地提供最大支持。
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