轉(zhuǎn)基因植物中的篩選基因

瀏覽次數(shù)：5415　發(fā)布日期：2014-8-20　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

基因工程（DNA重組技術(shù)）是在離體條件下對(duì)不同生物的遺傳物質(zhì)（DNA）進(jìn)行人為“加工”，并按照人們的意愿重新組合，以改變生物的性狀和功能，然后再通過適當(dāng)?shù)妮d體將重組DNA轉(zhuǎn)入生物體或細(xì)胞內(nèi)，并使其在生物體內(nèi)或細(xì)胞中表達(dá)，從而獲得新的生物機(jī)能。這種利用基因工程技術(shù)獲得的植物一般稱為“基因工程植物”。自1983年首次獲得轉(zhuǎn)基因植物以來，便深受育種工作者青睞，得到了蓬勃地發(fā)展。至今已有30多科約200多種植物轉(zhuǎn)基因成功；國(guó)際上相繼有30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)3000多例轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)入田間試驗(yàn)，并且在美國(guó)、加拿大、中國(guó)等20多個(gè)國(guó)家成功進(jìn)行了商品化生產(chǎn)。通過基因工程改良作物品種在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中日益顯示出巨大潛力。

轉(zhuǎn)基因的方法很多，最常用的有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法和基因槍轉(zhuǎn)化法。無論哪種方法，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比都只占少數(shù)，兩者存在競(jìng)爭(zhēng)，而作為異種細(xì)胞的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的競(jìng)爭(zhēng)力很弱。因此，必須對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。

在有選擇壓力的條件下，利用抗性基因在轉(zhuǎn)化體內(nèi)的表達(dá)，有利于從大量的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇出轉(zhuǎn)化克隆。目前使用的選擇性試劑主要有抗生素類、除草劑類、氨甲喋呤、氨基酸類。

1. 抗生素抗性基因：

npt, 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)卡那霉素, G418, 巴龍霉素及新霉素等具有抗性；

aphIV, 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)潮霉素具有抗性；

spt, 鏈霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)鏈霉素具有抗性；

cat, 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，使氯霉素喪失抗菌素活性；

Aacc3和aacc4, 慶大霉素3-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因，對(duì)慶大霉素有抗性；

ble, 博來霉素抗性基因，對(duì)博來霉素有抗性。

2. 抗除草劑抗性基因

bar, 編碼膦化麥黃酮乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT），使PPT（膦化麥黃酮）的自由氨基乙酰化而對(duì)PPT中毒。抗除草劑草丁膦和雙丙氨膦；

epsps, 草甘膦抗性標(biāo)記基因，抗草甘膦；

als,綠黃隆抗性標(biāo)記基因。

3. 顯色或發(fā)光報(bào)告基因

（1）GUS酶活性檢測(cè)

GUS使β－葡萄糖苷酶，能催化裂解一系列的葡萄糖苷，產(chǎn)生一系列具有發(fā)色基團(tuán)或發(fā)熒光的物質(zhì)，可用分光光度計(jì)、熒光計(jì)或組織化學(xué)法對(duì)GUS活性進(jìn)行定量和空間定位分析，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單靈敏。

（2）熒光素酶活性檢測(cè)

熒光素酶催化的底物使6-羥基喹啉類似物，在鎂離子、ATP及氧的作用下酶使底物脫羧，生成激活態(tài)的氧化熒光素，發(fā)射光子后，轉(zhuǎn)變成常態(tài)的氧化熒光素。

（3）綠色熒光蛋白檢測(cè)

GFP產(chǎn)生綠色熒光蛋白，在395nm和490nm的波長(zhǎng)下發(fā)出獨(dú)特的綠色熒光。

傳統(tǒng)的篩選方法是利用抗生素和除草劑類選擇劑，但這些物質(zhì)對(duì)人類和環(huán)境的影響還不完全了解，因此，非抗生素篩選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

甘露糖陽性選擇系統(tǒng)屬于非抗生素篩選系統(tǒng)之一，其原理是：甘露糖不能維持各種外植體的生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)植物細(xì)胞添加甘露糖時(shí)，它只被轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，不能進(jìn)一步參與代謝，而積累至毒性水平�？茖W(xué)家克隆編碼6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶的基因作選擇基因，構(gòu)建表達(dá)載體遺傳轉(zhuǎn)化植物，用甘露糖作選擇劑，選擇基因編碼的6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶則可將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為易于糖酵解的6-磷酸果糖。

和傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化方法相比，包含甘露糖選擇在內(nèi)的新篩選方法有利于轉(zhuǎn)基因組織的再生和生長(zhǎng)，同時(shí)使非轉(zhuǎn)基因組織因饑餓而死，而不是殺死它們，稱之為正向選擇法；傳統(tǒng)的抗生素選擇法或除草劑選擇法將未轉(zhuǎn)化細(xì)胞殺死則被叫做負(fù)向選擇法。

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