免疫學(xué)技術(shù):懸浮細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)
免疫熒光標(biāo)記技術(shù)（immunofluorescence technique）是將已知的抗體或抗原分子標(biāo)記上熒光素，當(dāng)與其相對(duì)應(yīng)的抗原或抗體起反應(yīng)時(shí)，在形成的復(fù)合物上就帶有一定量的熒光素，在熒光顯微鏡下就可以看見(jiàn)發(fā)出熒光的抗原抗體結(jié)合部位，檢測(cè)出抗原或抗體。
實(shí)驗(yàn)方法
- 基本方案
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
懸浮細(xì)胞 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 |
多聚-L-賴氨酸 |
| 儀器、耗材 |
離心機(jī) 培養(yǎng)箱 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
1. 細(xì)胞在冰浴中冷卻，然后用臺(tái)式離心機(jī)于4℃以800 g 離心5 min，吸去培養(yǎng)液并以4℃PBS重懸細(xì)胞。
2. 離心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重懸細(xì)胞，置冰上固定30 min。
3. 離心、吸去固定液，用15 ml 4℃ PBS重懸細(xì)胞，放5 min 后，用PBS再次洗滌細(xì)胞。 4. 稀釋的第一抗體于4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min，250 μl 抗體足夠用于5×106細(xì)胞。 5. 離心細(xì)胞，吸去PBS，重懸細(xì)胞于第一抗體中，置4℃溫育1 h。
6. 用4℃ PBS稀釋細(xì)胞和抗體至15 ml。
7. 離心，吸去PBS，以4℃ PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)1次。
8. 第二抗體4℃用微量離心機(jī)以13 500 g 離心2 min，5×106細(xì)胞用250 μl 抗體足夠。
9. 吸去PBS，以第二抗體重懸細(xì)胞，4℃溫育1 h，重復(fù)步驟6及步驟7。 10. 除非立即觀察細(xì)胞，否則在進(jìn)行細(xì)胞濃縮的下一步操作之前應(yīng)以鋁萡包裹離心管并冷藏。 11. 離心細(xì)胞并以少量PBS重懸（勿用水），將細(xì)胞懸液滴于多聚-L-賴氨酸覆層的載玻片上，加上蓋玻片，盡可能馬上觀察結(jié)果。 |
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