免疫學技術(shù)專題：組織病理實驗介紹
組織學技術(shù)包括、組織學制片技術(shù)、胚胎學制片技術(shù)、組織化學技術(shù)、熒光組化及免疫組化技術(shù)、組織培養(yǎng)技術(shù)、各種特殊顯微技術(shù)、電鏡組織學技術(shù)。組織學技術(shù)不但應(yīng)用于組織學本學科，并且廣泛應(yīng)用于其他多學科，如生物學、解剖學、病理學、腫瘤學、法醫(yī)學、臨床診斷學等。
實驗方法
- 石蠟切片法
- 冰凍切片
| 實驗方法原理 | 石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。 |
|---|---|
| 實驗材料 |
小鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
中性福爾馬林固定液 酒精 二甲苯 石蠟 蜂蠟 蘇木精染液 伊紅酒精溶液 鹽酸酒精溶液 甘油蛋白粘片劑 中性樹膠 卡諾固定液 |
| 儀器、耗材 |
切片機 恒溫箱 蠟杯 酒精燈 解剖剪 培養(yǎng)皿 鑷子 單面刀片 包埋盒 染色缸 蓋玻片 載玻片 玻片盤 顯微鏡 溫度計 水浴鍋 |
| 實驗步驟 |
一、材料準備：
1. 中性甲醛固定液： 甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度）100 mL
磷酸氫二鈉6.5 g
磷酸二氫鉀（鈉）4 g
雙蒸水900 mL
2. 1%鹽酸乙醇液： 鹽酸1份
70%酒精100份
3. 甘油蛋白貼片劑： 蛋白50 ml
甘油50 ml
水楊酸鈉（防腐劑）1 g
4. 配制 （1）將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫。 （2）然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。 （3）此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。 （4）最后加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。 二、實驗步驟：
1. 取材 （1）頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。 （2）切取的組織塊不宜太大，以利于固定劑穿透，通常以5 mm×5 mm×2 mm或10 mm×10 mm×2 mm 為宜。 （3）取下所需要的肝組織，切成一小塊2~3 mm 厚。 2. 固定
（1）將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下 （2）立即投入中性福爾馬林固定液中固定 （3）固定30~50 min。 3. 洗滌
材料經(jīng)固定后，流水沖洗，數(shù)小時或過夜。 4. 脫水 （1）材料依次經(jīng)70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30 min。 （2）再放入95%、100%各2次，每次20 min。 5. 透明
（1）純酒精、二甲苯等量混合液15 min，二甲苯Ⅰ15 min、Ⅱ15 min（至透明為止）。 （2）由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。
（3）當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。 6. 透蠟
（1）放入二甲苯和石蠟各半的混合液15 min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50~60分鐘。 （2）透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織大小而定。 （3）透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5 h。 7. 包埋
（1）包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質(zhì)地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上。 （2）從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。 （3）再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。 （4）再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。 8. 切片
（1）將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物臺上。 （2）將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。 （3）搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。 （4）調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。 （5）調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。 （6）一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40~50 r/min。 （7）切成的蠟帶到20~30 cm 長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。 （8）用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。 （9）切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。 9. 展片、貼片 打開水浴鍋，使水溫維持在40~45℃，另準備30%乙醇溶液。 （1）切片時，將一碗30%乙醇溶液放于切片機旁的桌面上。 （2）用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。 （3）小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。 （4）另取潔凈的載玻片，撈起展開的切片，使其位于切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨面上標記或貼上標簽，放于切片架上。 10. 脫蠟復水 （1）將水浴鍋溫度調(diào)至60℃，待水溫控制在60℃時。 （2）將切片連同切片架放入一干燥的染色缸內(nèi)，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30 min 至蠟熔化。 （3）之后，石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5 min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3~5 min，再放入蒸餾水中3 min。 11. 染色
（1）切片放入蘇木精中染色約10~30 min。 （2）染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。 （3）室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。 12. 水洗
（1）用自來水流水沖洗約15 min。 （2）使切片顏色變藍（或放入堿性水中也可）。 （3）但要注意流水不能過大，以防切片脫落。 13. 分化
（1）將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色。 （2）約2秒至數(shù)十秒鐘，見切片變紅，顏色較淺即可。 14. 漂洗
切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。 15. 脫水Ⅰ 切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5 min。 16. 復染 （1）用0.5%伊紅乙醇液對比染色1~3 min。 （2）伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。 （3）反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染�？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。 17. 脫水Ⅱ
（1）將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色。 （2）然后放入無水乙醇中3~5 min。 （3）最后用吸水紙吸干多余的乙醇。 18. 透明
（1）切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5 min。 （2）二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。 （3）切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。 19. 封藏：中性樹膠封存
因切片經(jīng)二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。 20. 封藏的方法： （1）封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。 （2）材料透明后，在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上）。 （3）迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。 （4）如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。 （5）如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。 （6）染色結(jié)果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。
三、免疫組化染色
1. 石蠟切片，步驟同前。切片經(jīng)貼片后，60℃烤片30 min使蠟熔化，經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min，脫蠟。然后，將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3~5 min，再放入蒸餾水中3 min，水化。 2. 脫蠟和水化后，用PBS（pH7.4，具體看所用抗體及染色試劑說明）沖洗3次，每次3分鐘。洗瓶沖洗。 3. 根據(jù)抗體的要求，對組織抗原進行相應(yīng)的修復�？蛇x步驟，具體見抗體說明書。 4. 每張切片加1滴或50 μl 3%過氧化氫，室溫下孵育10分鐘，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次，每次3分鐘。此步驟是對內(nèi)源性過氧化物酶含量高的組織而言。 5. 除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 的第一抗體，室溫下孵育60分鐘或4℃過夜，具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次，每次3分鐘。 6. 除去PBS液，每張切片加1滴或50 μl 即用型MaxVisionTM試劑或SP試劑，室溫下孵育10~15分鐘。PBS沖洗3次，每次3分鐘。 7. 除去PBS液，每張切片加2滴或100 μl新鮮配制的DAB或AEC溶液，顯微鏡下觀察3~5分鐘（DAB）或37℃環(huán)境下10~30分鐘（AEC）。 8. 自來水沖洗，蘇木素復染10分鐘，PBS或自來水沖洗返藍。如果用DAB顯色，則切片經(jīng)過梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，步驟同H-E染色，中性樹膠封固；如果用AEC顯色，則切片不能經(jīng)酒精脫水，而直接用水性封片劑封片。 |
| 注意事項 |
一、取材注意事項
1. 取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。
2. 切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。 二、固定注意事項
1. 一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
2. 有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
3. 固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1~2次新液。
4. 材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。 三、脫水注意事項
1. 脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
2. 在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。
3. 在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
4. 在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
5. 如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。
6. 脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象。 四、透明注意事項
1. 使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
2. 更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。
3. 在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。 五、透蠟注意事項
1. 盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度。
2. 透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低。
3. 操作要迅速，力求在最短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。 |
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組織病理
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