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細(xì)胞技術(shù)專題：兔膀胱平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)實驗

瀏覽次數(shù)：1214　發(fā)布日期：2014-2-25　來源：上海北諾生物科技有限公司

酶分離法

	運用顯微手術(shù)器械在肉眼下仔細(xì)剔除膀胱黏膜層及漿膜層后，完整分離膀胱平滑肌層。然后以酶分離法獲取兔膀胱平滑肌細(xì)胞，體外原代和傳代培養(yǎng)分離細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況，同時進(jìn)行細(xì)胞爬片H-E染色和透射電鏡等形態(tài)學(xué)觀察分析，并應(yīng)用免疫熒光染色平滑肌特有的α-肌動蛋白進(jìn)行細(xì)胞學(xué)鑒定分析。最后根據(jù)細(xì)胞計數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線和增殖曲線。



	一、實驗方法 1. 膀胱平滑肌細(xì)胞酶法分離（5）用100 目細(xì)胞篩過濾該絮狀液，混懸液離心(1000 轉(zhuǎn)/分，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO₂、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)液每周更換 2-3 次。（3）加入適量的消化液，使其覆蓋整個細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO₂培養(yǎng)箱，不時在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。（5）細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后，按照 1X10⁵~10⁶細(xì)胞/mL 密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。采用倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞的形態(tài)及生長情況。細(xì)胞爬片HE 染色觀察細(xì)胞形態(tài)，電鏡檢查，免疫組化染色檢測α-SMA。二、結(jié)果兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時均可見膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長，正常兔 7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。本組中均傳至第8 代，經(jīng)第8 次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長迅速，未見衰老跡象。倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)(圖1 中對照組2 周的細(xì)胞；圖2 中實驗組培養(yǎng)2 周的細(xì)胞)。細(xì)胞爬片HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型(見圖 3)。電鏡檢查可見平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)(圖 4)。免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應(yīng)(圖 5)。從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測α-SMA 呈陽性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%。圖1. 對照組2周的細(xì)胞圖2. 實驗組培養(yǎng)2周的細(xì)胞圖 3. 細(xì)胞爬HE染色見膀胱平滑肌細(xì)胞，細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型圖4. 分離后培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞致密斑結(jié)構(gòu) 圖5. α-SMA免疫組化證實該方法能獲得單一膀胱平滑肌細(xì)胞(棕色為α-SMA陽性) 收起
	1. 應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。 2. 仔細(xì)徹底剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質(zhì)單個膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。 3. 膀胱平滑肌組織應(yīng)盡量減碎以確保充分消化。 4. 嚴(yán)格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時間，見消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見消化液中有較多單個細(xì)胞或細(xì)胞小團(tuán)塊時即終止消化。 5. 細(xì)胞篩的運用也是獲得高質(zhì)單個膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。收起
	一、實驗討論平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法可分為兩類：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細(xì)嫩、易碎的組織；其方法較簡單；但容易產(chǎn)生雜質(zhì)如成纖維細(xì)胞等，成纖維細(xì)胞生長快，故培養(yǎng)之細(xì)胞質(zhì)量較差；培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞無收縮性；且原代細(xì)胞的獲得需 3-4 周，獲得大量平滑肌細(xì)胞耗時長^[1]。既往酶消化法較組織塊法復(fù)雜、精細(xì)；適宜的酶濃度和培養(yǎng)時間的確定較為困難；然而在較短時間內(nèi)可獲得大量的平滑肌細(xì)胞，1996 年Chambers等^[2]報道酶消化法純度為70%�？梢娨环N快速、高效、高純度的酶消化法培養(yǎng)膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。膀胱平滑肌的鑒定^[3]主要根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及α-actin的檢測。二、參考文獻(xiàn) 1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24. 2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca²⁺ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564. 3. ChamLey CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture. Physiol Rev,1979,599(1):1-61. 4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca²⁺channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.

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