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細(xì)胞技術(shù)專題：大鼠肝星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

瀏覽次數(shù)：800　發(fā)布日期：2014-2-25　來(lái)源：上海北諾生物科技有限公司

胰酶消化法





	一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 動(dòng)物：雄性SD大鼠(體重250-450 g)。 2. 試劑：戊巴比妥鈉，小牛血清(或胎牛血清，則更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH₂PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO₃ 0.35 g/L，Na₂HPO₄.7H₂O 0.06 g/L或Na₂HPO₄ 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L)，HBSS，臺(tái)盼蘭等。 3. 器械：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。二、原代培養(yǎng)方法 1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺(tái)上剖腹，進(jìn)行門靜脈插管，以D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。 2. 待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。 3. 以HBSS重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞。 4. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并判斷存活率和產(chǎn)量，最后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2)，次日換液，以后每2-3天換液一次。三、傳代方法棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5% CO2，37℃)。展開(kāi)
	1. 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。 2. 采用無(wú)須原位消化的方案，完全可行，只不過(guò)消化時(shí)間更難控制！實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(最好5代以內(nèi))。展開(kāi)
	一、參考文獻(xiàn) 1. 袁桃霞，張錦生，張?jiān)露�，�? 大鼠肝Ito細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對(duì)其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 1996;23(2):90-93.

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