大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)可以:(1)用于血液流動(dòng)性、防止血栓形成、調(diào)節(jié)血管張力等研究;(2)用于選擇性通透性以及免疫調(diào)節(jié)等方面研究。
實(shí)驗(yàn)方法原理 |
貼塊法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),其方法較酶消化法簡便、經(jīng)濟(jì)。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近,后者貼壁較內(nèi)皮慢,而且會(huì)被肝素所抑制。 |
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實(shí)驗(yàn)材料 |
雄性Wistar大鼠 |
試劑、試劑盒 |
DMEM 胎牛血清 內(nèi)皮細(xì)胞生長因子 肝素鈉 青鏈霉素 明膠 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液 |
儀器、耗材 |
手術(shù)器械 眼科剪 眼科鑷 培養(yǎng)皿 手術(shù)刀 培養(yǎng)瓶 CO2培養(yǎng)箱 |
實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、實(shí)驗(yàn)方法
1. 頸椎脫臼處死大鼠,將整個(gè)大鼠浸泡于75%乙醇中消毒約1 min。在無菌狀態(tài)下,逐層剪開胸腔,分離取出主動(dòng)脈,放含無菌 D-Hanks’液培養(yǎng)皿中。 2. 用眼科剪、鑷盡量去除血管外膜的脂肪和纖維組織。然后,用含抗生素的D-Hanks’液沖洗血管的外表面及血管腔內(nèi)的凝血數(shù)次,再放入另一無菌培養(yǎng)皿中。 3. 用眼科剪縱向剪開血管,平展在培養(yǎng)皿中。用非常銳利的手術(shù)刀將其切成1 mm3 大小的動(dòng)脈植 塊(或者用剪刀剪,依照個(gè)人習(xí)慣),然后種植到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(培養(yǎng)瓶或皿用1%明膠預(yù)置 37℃下過夜, 使用前2 h 移入CO2培養(yǎng)箱中。用時(shí)可以先經(jīng)含 10%小牛血清的培養(yǎng)液沖洗)。將動(dòng)脈植塊的內(nèi)膜面與瓶底接觸,種植密度約為 1 塊/cm2 。 4. 置培養(yǎng)箱中靜置2 h(干貼壁)。然后,加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培養(yǎng)液,液量以略蓋過動(dòng)脈植塊內(nèi)膜面,而又不使植塊漂浮為宜。24 h 后,更換培養(yǎng)液,加入 2-3 ml 培養(yǎng)液。 5. 72 h 左右的時(shí)候,當(dāng)觀察到內(nèi)皮細(xì)胞充分長出,而成纖維細(xì)胞剛要長出的時(shí)候,將動(dòng)脈植塊除去,刮除成纖維細(xì)胞,換培養(yǎng)液1 次。以后每2 天換液一次,每次換1/2~1/3 的液量。繼續(xù)培養(yǎng) 8-10 d, 細(xì)胞融合成單層,即可傳代。 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 植塊培養(yǎng)法進(jìn)行的原代培養(yǎng),一般在培養(yǎng)2-3 天,動(dòng)脈植塊周圍即有細(xì)胞生長,并漸向外延伸,呈扁平短梭形或多角形;約8-10 d 后細(xì)胞融合成片。采用vWF 免疫組化鑒定,主要表達(dá)在細(xì)胞漿中。 |
其他 |
一、實(shí)驗(yàn)討論
植塊培養(yǎng)法適用于內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)量低的、管徑較小血管的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),其方法較酶消化法簡便、經(jīng)濟(jì)。但缺點(diǎn)使易混有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,前者的貼壁時(shí)間和內(nèi)皮接近,后者貼壁較內(nèi)皮慢,而且會(huì)被肝素所抑制。
而由于成纖維細(xì)胞生長較快,隨著傳代次數(shù)越多,其污染的程度越重,從而使培養(yǎng)失敗。因而,抑制和減少成纖維細(xì)胞是大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵問題。本法采用的方法是:
1. 在合適的時(shí)間去除動(dòng)脈塊,即當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出,初具規(guī)模時(shí)(大概在72 h 左右的時(shí)候,按照本文的培養(yǎng)液條件,因?yàn)橛猩L因子,內(nèi)皮容易爬出和增殖),去除動(dòng)脈塊,并刮除成纖維細(xì)胞。 2. 使用含肝素的培養(yǎng)液(在培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的肝素),可使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高; 3. 高濃度的血清和50 µg/ml ECGF 可以充分地促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,而使內(nèi)皮細(xì)胞成為優(yōu)勢細(xì)胞。另外,動(dòng)脈植塊干貼壁的時(shí)間不宜超過2 h,而加培養(yǎng)液這一步驟尤為關(guān)鍵,過少會(huì)使內(nèi)膜接觸不到培養(yǎng)液,過多則易使動(dòng)脈小塊漂浮,導(dǎo)致貼壁失敗。因此,干貼壁后加培養(yǎng)液,加入少量高營養(yǎng)的培養(yǎng)液(0.5-1 ml),可以避免這些問題。 組織塊貼塊的時(shí)候,不可避免會(huì)有一些塊貼的方向不是內(nèi)膜面,那么最后將爬不出內(nèi)皮,甚至長出較多雜質(zhì)細(xì)胞,需刮除。
另外,部分塊即使大小合適,方向也正確,也可能爬不出來,去除組織塊的時(shí)候,應(yīng)該以大局為重,看到內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)爬出較多,而雜質(zhì)細(xì)胞也開始爬出的時(shí)候,就要果斷地去除組織塊了。72 h 只是個(gè)大概的時(shí)間,初學(xué)者不可以拘泥。 |