【材料與試劑】
(1)30%的:分別稱取29g ,1g N,N -亞甲雙加溫?zé)岬娜ルx子水60ml,加熱至37℃溶解,補(bǔ)加水至終體積為100ml,過(guò)濾,即配成30%(w/v)貯存溶液。和雙在貯存過(guò)程中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸,這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化,故溶液的pH值不超過(guò)7.0,應(yīng)置于棕色瓶中4℃保存。
(2)10%十二烷基硫酸鈉(SDS):稱取10gSDS加去離子水90ml加熱至68℃,加幾滴濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH7.2加水至100ml,即為10%(w/v)SDS。
(3)濃縮膠緩沖液(1mol/L Tris-HCl pH 6.8):12.12g Tris溶解在80ml去離子水中,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8,再加去離子水至100ml。4℃保存。
(4)分離膠緩沖液(1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8):18.16g Tris溶解在80ml去離子水中,用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8, 再加去離子水至100ml。4℃保存。
(5)10%過(guò)硫酸胺(AP):過(guò)硫酸胺提供催化和雙聚合所必需的自由基,可用去離子水配制小量10%(W/V)貯存液并4℃保存。由于過(guò)硫酸胺會(huì)緩慢分解,故應(yīng)隔周新鮮配制。
(6)TEMED(N , N , N, N -四甲基乙二胺)TEMED通過(guò)催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速和雙的聚合,由于TEMED只能以游離堿的形式發(fā)揮作用,因此pH值較低時(shí)聚合反應(yīng)受到抑制。
(7)Tris-甘氨酸電泳緩沖液:分別稱取15.1g Tris 和94g甘氨酸,溶解在900 ml去離子水中,然后加入50 ml 10%(w/v)SDS,再加去離子水至1000 ml則成5?貯存液。使用時(shí)稀釋5倍,終濃度Tris為25mmol/L、甘氨酸為250mmol/L、0.1%SDS,緩沖液pH為(8.3)。
(8)聚凝膠電泳槽和電泳儀
(9)加樣器和吸頭等
【操作方法】
(1) 根據(jù)垂直電泳槽說(shuō)明書(shū)安裝玻璃板,確定需配制分離膠的濃度和體積,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚凝膠電泳分離膠所用溶液”所列成分(見(jiàn)書(shū)末附錄)配制所需分離膠;
(2) 迅速將分離膠注入兩玻璃板間隙中,留出灌注積層膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加1cm,用滴管小心地在分離膠上覆蓋一層0.1% SDS(當(dāng)濃度≤8%時(shí))或異丁醇或水(當(dāng)濃度≥10%時(shí)),覆蓋層可防止氧擴(kuò)散進(jìn)入凝膠而抑制聚合反應(yīng)。將凝膠垂直置于室溫下;
(3) 分離膠聚合完全后,倒出覆蓋層液體,用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次以除去未聚合的,盡可能排除凝膠上的液體;
(4) 確定需配制濃縮膠的體積,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚凝膠電泳濃縮膠所用溶液”(見(jiàn)書(shū)末附錄)配制所需濃縮膠,然后直接將濃縮膠灌注在分離膠上,立即插入干凈的配套梳子,避免氣泡,然后加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙。待濃縮膠聚合后,拔出梳子,形成加樣孔;
(5) 用去離子水將Tris-甘氨酸電泳緩沖液貯存液稀釋5倍,倒入電泳槽,將加樣孔充滿,這時(shí)加樣孔中的氣泡可通過(guò)電泳緩沖液排除。