PCR 序列特異性引物（sequence specific primer,SSP）分析法是使用能夠特異識別特定等位基因的引物通過PCR擴增檢測序列多態(tài)性的方法，也稱作等位基因特異性引物PCR 法。本實驗是應(yīng)用PCR-SSP 法檢測MN 基因型。

[實驗原理]

根據(jù)決定某等位基因的堿基性質(zhì)，設(shè)計3′端第一個堿基分別與各等位基因的特異性堿基相匹配的序列特異性引物，在PCR反應(yīng)過程中，只有引物3′端第一個堿基與決定特定等位基因的堿基互補時才能實現(xiàn)DNA 片段的完全復(fù)制，根據(jù)PCR 產(chǎn)物的有無進行等位基因的分型。

[實驗器材]

PCR 擴增儀、電泳儀、電泳槽。

[實驗試劑]

引物1：5′-GCATCAAGTACCACTGGT-3′；引物2：5′-GCATTAAGTACCACTGAG-3′；共通引物：5′-GAGAAGTTGAGAAAGGGGT-3′。模板DNA、Taq 聚合酶、、電極緩沖液、上樣緩沖液等

[實驗方法]

1.PCR擴增PCR反應(yīng)體系為20μl（2個體系，分別為引物1和引物2），含模板2μl(約50ng)，引物各1.5μl,dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶1.0U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應(yīng)條件為94℃4min,94℃1.5min/52℃2.0min/72℃2.0min，30個循環(huán)。

2.PCR 擴增產(chǎn)物的檢測 取PCR擴增產(chǎn)物2μl，6%聚凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。銀染顯色

[結(jié)果判定]

根據(jù)電泳譜帶的有無判定等位基因型別，僅有1 個體系檢測到譜帶者為相應(yīng)特異性引物對應(yīng)型（M 或N），2 個體系均檢測到譜帶者為MN 型。

[實驗討論]

1.注意事項 ①如引物結(jié)合序列存在堿基變異可能無擴增產(chǎn)物，導(dǎo)致錯誤判型；②在對照樣品分型準(zhǔn)確的基礎(chǔ)上才能判定結(jié)果。

2.方法評價 該方法操作簡單，引物設(shè)計與實驗的復(fù)性條件要求較高。