PCR技術(shù)專題：巢式PCR

瀏覽次數(shù)：4204　發(fā)布日期：2013-11-20　來源：上海北諾生物科技有限公司

標(biāo)簽：巢式 PCR

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對（而非一對）PCR引物擴(kuò)增完整的片段。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部）結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。

實(shí)驗方法

基本方案

實(shí)驗方法原理	由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性（因為與兩套引物都互補(bǔ)的引物很少）增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點(diǎn)的可能性極小，因此第二套引物不可能擴(kuò)增非目的片斷。這種巢式PCR擴(kuò)增確保第二輪PCR產(chǎn)物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強(qiáng)造成的非特異性擴(kuò)增的污染。巢式PCR反應(yīng)模式圖
實(shí)驗材料
試劑、試劑盒
儀器、耗材
實(shí)驗步驟	1. 目標(biāo)的DNA模板藍(lán)色的第一對引物結(jié)合。第一對引物也可能結(jié)合到其他具有相似結(jié)合位點(diǎn)的片段上并擴(kuò)增多種產(chǎn)物。但只有一種產(chǎn)物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產(chǎn)物）。 2. 使用圖中紅色標(biāo)記的第二套引物對第一輪PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。第一輪 1. 大�。�1192 bp 2. 初始孵育：94℃4分鐘 3. 變性：94℃45秒 4. 退火：58攝氏度45秒 5. 聚合：72攝氏度45秒 6. PCR循環(huán)：36 第二輪 1. 大�。�271 bp 2. 初始溫育：95℃2分鐘 3. 變性：95℃45秒 4. 退火：60℃下45秒 5. 聚合：72攝氏度30秒 6. PCR循環(huán)：36 收起
注意事項	1. 引物設(shè)計原則：每個特異性引物為24~26個堿基，Tm：64-65%，GC：44-55% 。這樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。 2. 在第一輪PCR結(jié)束之后，將PCR產(chǎn)物稀釋1 000倍（視情況而定）作為第二輪PCR的模板，第二輪PCR的產(chǎn)物同樣稀釋1 000倍（視情況而定）作為第三輪PCR的模板，這樣依次類推。實(shí)際操作中可以搞3輪甚至更多，當(dāng)然做3輪是比較合適了，這個時候PCR的產(chǎn)物已經(jīng)是高度特異性了。展開
其他	1. 圖解

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