限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment lengthpolymorphism,RFLP）分析技術(shù)是分子生物學(xué)的重要分析方法之一，用于檢測DNA序列多態(tài)性。PCR-RFLP 是將PCR技術(shù)、RFLP 分析與電泳方法聯(lián)合應(yīng)用，先將待測的靶DNA 片段進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增，然后應(yīng)用DNA限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后經(jīng)電泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型。

本實(shí)驗將應(yīng)用RFLP 分析技術(shù)檢測NMDA 受體中的GRIN2A 亞基基因3 號內(nèi)含子中的2 個SNP 位點(diǎn)rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。

[實(shí)驗原理]

DNA 限制性內(nèi)切酶具有識別特定的DNA 序列并在特定的部位切斷DNA 雙鏈的活性功能，DNA分子由于突變（核苷酸的置換、插入或缺失）改變（或形成）了限制性內(nèi)切酶識別序列，使DNA 限制性內(nèi)切酶不能（或可以）將靶DNA片段切斷，電泳檢測時，存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段變成短片段；不存在相應(yīng)DNA 限制性內(nèi)切酶識別序列者原DNA 片段長度將不發(fā)生變化。

[實(shí)驗器材]

PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、微波爐、恒溫箱或恒溫水浴等。

[實(shí)驗試劑]

限制性內(nèi)切酶BstNI、模板DNA、Taq聚合酶、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）、、酶消化緩沖液、電極緩沖液、上樣緩沖液等。

[實(shí)驗方法]

1.PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為20μl，含模板2μl(約50ng)，引物各1.6μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer緩沖液2μl，Taq酶0.5U，加雙蒸水至20.0μl；PCR反應(yīng)條件為95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec(5個循環(huán))，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5個循環(huán))，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec(23個循環(huán))，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，以1%的瓊脂糖凝膠潛水電泳法檢測靶DNA 片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。

3.酶消化反應(yīng)：取PCR 產(chǎn)物約2.0μl，加限制性內(nèi)切酶BstN I1U，10×酶消化反應(yīng)緩沖液1.0μl，蒸溜水補(bǔ)至10.0μl 置試驗管中。37℃溫箱中孵育4h。

4.酶切產(chǎn)物電泳分型：6%聚凝膠電泳（T=6%，C=3.3%，凝膠規(guī)格為82mm×64mm×0.75mm）。電極緩沖液為1×TBE。將加有1/5體積上樣緩沖液的酶切產(chǎn)物電泳，220 v 電壓，電泳2－3h。

5.銀染顯色將凝膠剝離至染色盤中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸餾水沖洗凝膠3 次（2min以內(nèi)）。將0.1%硝酸銀溶液200ml 倒入染色盤中，染色30min，倒掉染色液，蒸餾水快速沖洗凝膠1 次（20s以內(nèi)）。顯色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盤中，不斷震蕩，直至譜帶顯示清晰。用固定液終止顯色。蒸餾水洗滌一次，貼于濾紙上晾干保存。

[結(jié)果判定]

本實(shí)驗PCR 產(chǎn)物長度為379bp，rs17750303 位點(diǎn)位于140bp 處，為A/C突變。rs837690 位點(diǎn)位于175bp處，為AG 突變。兩個位點(diǎn)均為BstN I 酶識別部位，酶切后可以產(chǎn)生1-4（6 種）個DNA 片斷，根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度可出現(xiàn)10 種譜型（基因型組）見下表。

根據(jù)酶切片段數(shù)量與長度確定rs17750303－rs837690 位點(diǎn)基因型組合

GRIN2A 基因rs17750303 與rs837690 位點(diǎn)的RFLP 電泳譜型

1.DNA 長度標(biāo)準(zhǔn)品；2.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；3.AA-AA 型；4.CC-AG 型；5.AC-AA型,；6.AC-GG 型，；7.CC-AA型；8.CC-GG 型；9.AA-GG 型；10.CA-AG 型。

[實(shí)驗討論]

1.注意事項 ①靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物要純，如有非特異產(chǎn)物（特別是大片段可能含有酶識別序列）將競爭酶活性，使樣品消化不完全或及出現(xiàn)酶消化雜帶；②酶消化過程要充分（即底物與酶的比例要合適，消化時間要保證），避免假陰性結(jié)果；③酶切陽性結(jié)果可以確定所檢測具體序列，陰性結(jié)果僅可說明非酶識別序列，但不能準(zhǔn)確判定具體序列。④酶識別序列如有甲基化之核苷酸將不被切割。

2.方法評價 該方法操作簡單，結(jié)果容易判定。