擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示：C＝C0 (1+P)ⁿ 。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量，C0 為起始DNA量， P為增效率， n為循環(huán)次數(shù)。

在擴(kuò)增后期，由于產(chǎn)物積累，使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線(xiàn)，產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升，這稱(chēng)為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。

三、PCR產(chǎn)物的克隆

在許多研究中，需要將PCR產(chǎn)物克隆，以獲得目的DNA片段。此時(shí)，所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小，以減少平臺(tái)效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體中有下列一些方法。

1、 平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴(lài)堿基，在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前，可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。

2、在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會(huì)在3'端加上多余的非模板依賴(lài)堿基，而且對(duì)A優(yōu)先聚合，所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn)，可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT，使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP，ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵，保證在載體3'端只加上一個(gè)ddTTP，而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接，連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個(gè)切口，這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌，并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開(kāi)發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。

3、粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn)，直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端，與載體連接，產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。

材料、設(shè)備及試劑

一、材料

不同來(lái)源的模板DNA。

二、設(shè)備

移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴(kuò)增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺(tái)式高速離心機(jī)。

三、試劑：

1、10×PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.0， 1.0％ Triton X-100。
　　2、MgCl₂ ：25mmol/L。
　　3、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。
　　4、Taq DNA聚合酶5U/μl。
　　5、T4 DNA連接酶及連接緩沖液。
　　6、經(jīng)SmaⅠ酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。
　　7、其它試劑：礦物油（石蠟油），1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，無(wú)水乙醇和70％ 乙醇。

操作步驟

一、PCR反應(yīng)

1、 依次混勻下列試劑

35μl H₂ O
　　5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液
　　4μl 25mmol/L MgCl2
　　4μl 4種dNTP
　　0.5μl 上游引物（引物１）
　　0.5μl 下游引物（引物２）
　　0.5μl 模板DNA(約1ng)

混勻后離心5秒。

2、將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數(shù)秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5μl約2.5U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。

3、 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。

二、電泳

取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長(zhǎng)度。

三、PCR產(chǎn)物的純化

擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。

（一）酚/氯仿法

1、取反應(yīng)產(chǎn)物加100μl TE.。
　　2、加等體積氯仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。
　　3、再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。
　　4、在水相中加300μl 95％乙醇，置-20℃下30min沉淀。
　　5、在小離心機(jī)上10000rpm離心10min，吸凈上清液。加入1ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH₂O 中，待用。

（二）Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)

Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測(cè)序、標(biāo)記、克隆等。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：
　　50ml Wizard PCR DNA純化樹(shù)脂
　　5ml 直接提取緩沖液
　　50支 Wizard微型柱

1、吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5ml eppendorf管中。
　　2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
　　3、加1ml PCR DNA純化樹(shù)脂，1分鐘內(nèi)渦旋混合3次。
　　4、取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。
　　5、將注射器與微型柱分開(kāi)，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2ml 80%異丙醇，對(duì)微型柱進(jìn)行清洗。
　　6、取出微型柱置于eppendorf管中，12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
　　7、將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50μl TE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。
　　8、丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。

[注意]

1、純化樹(shù)脂在使用前必須充分混勻。
　　2、PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會(huì)影響提取DNA的 產(chǎn)量。

四、載體加dT尾

1、將1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
　　2、在小管中按上述PCR反應(yīng)，加入各種混合物，除將4μl 4種dNTP改為4μl 25mM dTTP。
　　3、加入1μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2h。
　　4、按前面三中所述，用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。
　　5、加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1hr。
　　6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。

五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接

1、在7ml PCR產(chǎn)物中加1ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。
　　2、加1ml T4DNA連接酶，1ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過(guò)夜。
　　3、取5ml連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。

六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接

1、 在50ml的PCR產(chǎn)物中，直接加0.5ml T4 DNA聚合酶混勻。
　　2、 37℃反應(yīng)10分鐘后，70℃滅活10分鐘。
　　3、 用酚:氯仿抽提2次。
　　4、乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7ml ddH2O中。
　　5、 質(zhì)粒用Smal 切開(kāi)后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1ml （約0.1mg）加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1ml ，連接緩沖液1ml 。
　　6、取5ml 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞并篩選重組子。

[注意]

1、PCR非常靈敏， 操作應(yīng)盡可能在無(wú)菌操作臺(tái)中進(jìn)行。
　　2、吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌， 每次吸頭用畢應(yīng)更換， 不要互相污染試劑。
　　3、加試劑前， 應(yīng)短促離心10秒鐘， 然后再打開(kāi)管蓋， 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面。
　　4、應(yīng)設(shè)含除模板DNA所有其它成分的負(fù)對(duì)照。