1.  儀器

超凈工作臺，恒溫?fù)u床，冷凍高速離心機(jī)，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰柜，分光光度計(jì)，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進(jìn)樣器及吸頭。

 

以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。

 

2.  材料

土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株

 

3.  試劑

（1）YEB液體培養(yǎng)基（1 L）：酵母提取物1 g，牛肉膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，pH7.0，高壓滅菌。

 

（2）利福平（Rif）儲液：50 mg/ml

 

（3）20 mM CaCl₂，高壓滅菌。

 

 

1.  挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404單菌落于3 ml的YEB液體培養(yǎng)基（含Rif 50 mg/l）中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。

 

2.  取過夜培養(yǎng)菌液1 ml接種于50 ml YEB（Rif 50 mg/l）液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5。

 

3.  取2 ml菌液，13 000 rpm，離心30 sec，棄上清。

 

4、加入1000 μl 20 mM CaCl₂，使農(nóng)桿菌細(xì)胞充分懸浮，冰浴30 min。

 

5、13 000 rpm，離心30 sec，棄上清，置于冰上，加入500 μl預(yù)冷的20 mM CaCl₂，充分懸浮細(xì)胞，冰浴中保存，24 hr內(nèi)使用，或液氮中速凍1 min，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/DIV>