雙元載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

1.1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

1.1.1. 取-70℃保存的EHA105于含50μg/ml鏈霉素平板劃線，28℃培養(yǎng)。

1.1.2. 挑取單菌落接種于5ml YM液體培養(yǎng)基中，220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)12-16 hr。

1.1.3. 取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml YM液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5。

1.1.4. 轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm離心5min,去上清液。

1.1.5. 加入10ml預(yù)冷的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置20min。4℃5000rpm離心5min，去上清。

1.1.6. 加入4ml預(yù)冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液，輕輕懸浮。

1.1.7. 農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌Eppendorf管中，每管200μl凍存于-70℃。

1.2. 雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105

取1μg左右的質(zhì)粒DNA加入到200ml EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴30min，-70℃放置10min 。再在37℃水浴5min或42℃水浴1min，接著冰浴2min，加入800mlYM液體培養(yǎng)基28℃，175rpm搖培3hr后涂在含50μg/ml Kanamycin的YM平板上。28℃培養(yǎng)到形成單菌落。

其中 YM 可以用LB 代替 ，第一次的 CaCl₂ 溶液可用溶液（0.1MCaCl₂ 0.01Tris-HCl（7.0） 0.01 DTT）替代。