實(shí)驗(yàn)材料 |
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試劑、試劑盒 |
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儀器、耗材 |
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實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、試劑配制
1. SP 鹽
0.2%( NH4 )2SO4,1.4% K2HPO4,0.6% KH2PO4, 0.02% MgSO4·7H2O, 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE (100×)
2 % Casamino acid,10%酵母膏。 3. SPI 培養(yǎng)基
SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液,1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養(yǎng)基 SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl2 溶液,1 %體積250 mmol/L MgCl2 溶液。 5. SP-A Salts Solution(500 ml)
(1)0.4% (NH4)2SO4 :2 g (2)2.8% K2HPO4·3H2O :14 g (3)1.2% KH2PO4 :6 g (4)0.2% Trisodium Citrate Dihydrate :1g (5)121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution(500 ml)
(1)0.04% MgSO4·7H2O: 0.2 g (2)121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution(100 ml)
(1)2% Casamino acid :2 g
(2)10% Yeast Extract:10 g (3)121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium(20 mL)
SP-A Salts Solution:9.8 mL SP-B Salts Solution:9.8 mL (1%V)Glucose(50%w/v,115°C滅菌20 min) :200 μL (1%V)100×CAYE:200 μL 10. SPII Medium(6 mL)
SPI Medium:5.88mL (1%V)50mM CaCl2 :60μL (1%V)250mM MgCl2:60μL 11. 100×EGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液,溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板,取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板,37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中,37°C,250 r/min 培養(yǎng)過(guò)夜。
3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中,37°C,250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(168 約4-5 h)。
4. 取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中,37 °C,100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。
5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA,再于37°C,100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。
6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管,各加入5 μl DNA(DNA 量不能過(guò)高,不超過(guò)5 μg),再于37 °C,250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘,取菌液涂布篩選平板。
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注意事項(xiàng) |
1. 注意儀器用品的干凈和無(wú)菌。 2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng),以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài),不要使用玻璃試管。 3. 注意測(cè)定OD值,一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。 4. 保證菌體的濃度,可以提高轉(zhuǎn)化率。 |