人體內(nèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)猶如印度的圣河 – 恒河，河水中攜帶的養(yǎng)分滋養(yǎng)著古老的大地；洗滌帶走地上的ㄧ切污穢，人們的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中充斥著各種物質(zhì)，有廢物有養(yǎng)分，只要你想都可以從河水中撈取。同樣的我們的循環(huán)系統(tǒng)如同恒河；流動(dòng)的血液如同恒河水，身體所需的ㄧ切由血液運(yùn)送，身體產(chǎn)生的廢物也由血液清運(yùn)，同樣可以想象血中的成份也是包羅萬象。如果我們想知道大地有多純凈或污染有多嚴(yán)重，只要取一瓢水加以檢視就可以知道答案；而相同的想了解人的生理狀況，取一滴血加以檢驗(yàn)也可以知道端倪，但是做這些檢測(cè)并非漫無目標(biāo)的，必須要知道哪ㄧ些物質(zhì)是所謂的指針，在生物體內(nèi)的這些指針就是我們熟知的生物標(biāo)記(biomarker)。生物標(biāo)記的研究和應(yīng)用已有ㄧ段光景，各項(xiàng)代謝疾病的篩檢廣泛的被使用，而在癌癥的篩檢也已經(jīng)有ㄧ些不錯(cuò)的生物標(biāo)記，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。順著 microRNA (miRNA) 的發(fā)現(xiàn)和研究熱潮，已經(jīng)約有 1000 個(gè) miRNA 被發(fā)掘表現(xiàn)于人體中，miRNA 調(diào)控人體內(nèi)基因表現(xiàn)的生理功能也為人們所熟知，加上 miRNA 相對(duì)于蛋白質(zhì)標(biāo)志的高穩(wěn)定性，伴隨著檢測(cè)技術(shù)的一日千里，讓血液中的 miRNA 表現(xiàn)成為新一代尋找生物標(biāo)記的標(biāo)的。本文內(nèi)容介紹主要是以實(shí)驗(yàn)室在操作血清 miRNA 的萃取和芯片實(shí)驗(yàn)所累積的經(jīng)驗(yàn)，和讀者分享實(shí)驗(yàn)上遇到的ㄧ些難題和解決的方法。
 
血液中 miRNA 的組成
        血液中的 miRNA 到底是從何而來? 要往哪里去? 這些 miRNA 的生理功能是什么?以上這三個(gè)問題是很多研究人員關(guān)心的問題，事實(shí)上這些問題目前并沒有很明確的答案，我們知道 miRNA 是內(nèi)生性的短片段 RNA，長度約 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 結(jié)合誘導(dǎo)信息 RNA 的降解，進(jìn)而調(diào)控信息 RNA 和相對(duì)蛋白的表現(xiàn)。根據(jù)一些論文的揭示1和實(shí)驗(yàn)室實(shí)際的操作經(jīng)驗(yàn)顯示，正常人的血液中 miRNA 的含量是極微量的，但是在病人和檢體制備不佳的血液樣本中卻可抽取到較大量的 miRNA，根據(jù)這些觀察現(xiàn)象的合理臆測(cè)，病人血清中 miRNA 的來源，很有可能是因疾病造成的組織壞死或細(xì)胞凋亡破裂而流泄出來的胞內(nèi) miRNA，經(jīng)由病人和正常人的基因表現(xiàn)的芯片圖譜比較，結(jié)果也傾向有或無表現(xiàn)的差異，而非特定 miRNA 表現(xiàn)量上升；換言之，我們觀察到相關(guān)的研究中，病人的 miRNA的表現(xiàn)數(shù)目增加了，而分析ㄧ些在正常人和病人中都有表現(xiàn)的 miRNA，表現(xiàn)量的高、低反而是其次的表征。因此數(shù)據(jù)分析的邏輯和方法也必須根據(jù)之而調(diào)整，但這些呈現(xiàn)異位性表現(xiàn)(ectopic expression)的 miRNA 并不影響其成為診斷疾病和預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志的可能性。已經(jīng)有一些研究指出，這些不經(jīng)常表現(xiàn)在循環(huán)系統(tǒng)的 miRNA 可以成為良好的疾病診斷標(biāo)志，如 miR-141 可以作為前列腺癌的指標(biāo)，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞(myocardial infraction)相關(guān)，miR-122 和藥物造成的肝臟損傷有關(guān)。
 
血清中 miRNA 抽提的挑戰(zhàn)
1、檢體的備制：血清(serum)好還是血漿(plasma)好?
    臨床上會(huì)根據(jù)檢驗(yàn)的標(biāo)的來選擇血液檢體的保存及制備方式，血清和血漿都是來自血液檢體的成分，但是根據(jù)制備的方式導(dǎo)致本質(zhì)上含有成分有所不同。基于制備的方法可知，血清是血液經(jīng)由凝血反應(yīng)后，再經(jīng)由離心沈淀所得到的上清液。而血漿則是血液在不凝血的狀況下，經(jīng)由離心去除血球后的液體。然而有文獻(xiàn)指出，針對(duì)同一個(gè)人的血清和血漿樣本抽提出來的 miRNA 的總量作比較，很明顯的血清抽提的總量明顯比血漿抽提的來得高，這意謂著制備的方法也會(huì)影響miRNA 的抽提，據(jù)推測(cè)這些 miRNA 可能是因?yàn)槟�血反�?yīng)，血小板或紅血球破裂后釋出的物質(zhì)，其中包含 miRNA，雖然大部分的實(shí)時(shí)定量聚合鏈反應(yīng)(q-PCR)驗(yàn)證結(jié)果顯示，血漿和血液的 miRNA 的表現(xiàn)圖譜并無顯著差異，然而這個(gè)已經(jīng)存在的風(fēng)險(xiǎn)，可能在研究設(shè)計(jì)也是需要被考慮，因此就理論上來說，是以血漿的檢體較適合作為生物標(biāo)記的找尋。
 
2、檢體的備制或保存不良是否可用?
    已知血清或血漿中的 miRNA 的來源可能來自胞內(nèi)和胞外，尤其是血球(紅血球或白血球等)，因此處理方式不當(dāng)會(huì)造成檢體的污染，改變 miRNA 的組成和表現(xiàn)量，造成研究結(jié)果的偏差，尤其紅血球的溶血現(xiàn)象影響甚劇，不僅會(huì)造成紅血球 miRNA 污染而且紅血球中的大片段 mRNA 亦會(huì)造成定量的失準(zhǔn)和因降解而形成實(shí)驗(yàn)的偽陽性產(chǎn)生。因此備制檢體時(shí)也要避免造成血球破裂的動(dòng)作，如用太細(xì)的針頭抽血、或檢體保存不當(dāng)造成溶血、或病人本身因疾病或治療造成的敗血或溶血現(xiàn)象可能也是必須列入評(píng)估的考慮因素。此外抗凝血?jiǎng)┑氖褂帽仨毐苊馐褂煤�有肝�?heparin 的凝血管，已知 heparin 會(huì)抑制反轉(zhuǎn)錄 (reverse transcription) 和聚合酶 (polymerase) 的反應(yīng)，如果檢體會(huì)進(jìn)行 q-PCR 的驗(yàn)證一定要避免。同樣的血液檢體也含有抑制反轉(zhuǎn)錄和聚合酶的成分，如果萃取時(shí)沒有移除干凈則會(huì)造成后續(xù)實(shí)驗(yàn)的失敗產(chǎn)生。
 
miRNA 的抽提方法
    基本上血液中的 miRNA 也是 RNA，只是片段較短，因此萃取的方式和原理和其他 RNA 的萃取方式大同小異，目前市面上也有許多的萃取套組可供選擇，萃取的方式以有機(jī)溶劑如：Trizol LS，或通管柱(column)的方式進(jìn)行，均可以有不錯(cuò)的回收率，抽提方式可以參考今年 4 月份華聯(lián)快訊 – RNA 抽提。只有一點(diǎn)要特別提醒讀者的，使用有機(jī)溶劑方式萃取(phenol-chloroform)容易會(huì)有鹽類和有機(jī)溶劑殘留，會(huì)影響定量和抑制后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作反應(yīng)，因此操作上必須避免抽取到有機(jī)溶劑，可增加酒精清洗步驟一到兩次，洗去殘留鹽類。當(dāng)然使用管柱抽提可以輕易避免這些潛在問題的風(fēng)險(xiǎn)。
 
miRNA 的定量
      在抽提成功的情形下，血清和血漿中僅含有少量的 RNA，1 mL 血的抽提總量可能都在 ng 甚或 pg 等級(jí)，這樣的結(jié)果意謂著，運(yùn)用現(xiàn)行的分亮度計(jì)來測(cè) OD 是不可行的(以 NaroDrop 為例：待測(cè)濃度需高達(dá)10ng/uL才可信)，而Agilent bioanalyzer 2100 也僅能做到定性的檢測(cè)，沒法做精準(zhǔn)的定量。檢視現(xiàn)行被使用的定量方法大概有：(一)在等體積的血清或血液樣本中加入外控核酸(spike)，經(jīng)由抽提步驟后可經(jīng)由偵測(cè)外加的 spike 來校正抽提的總量及效率，作為校正檢體因抽提效率或誤差造成的差異。然而這只適用在檢體備制完美及控制抽取技術(shù)無誤，對(duì)于個(gè)體表現(xiàn)差異大和檢體備制質(zhì)量不一的檢體，并沒有辦法達(dá)到管控的效用；(二)經(jīng)過分亮度計(jì)測(cè) OD 加以定量，但是除非抽提出的量達(dá)到分亮度計(jì)的可信水平，否則這些數(shù)值大概都是假訊號(hào)，并不足以采信；(三) 使用內(nèi)控基因的表現(xiàn)量來做為校正。但根據(jù)研究指出其實(shí)血清或血漿中 miRNA 的表現(xiàn)數(shù)量是有很大的個(gè)體差異的，以正常人當(dāng)研究對(duì)象分析其表現(xiàn)的 miRNA 數(shù)量，最低 123 個(gè)；最高有 296 個(gè)1，可以有高達(dá)兩倍的差距，再加上沒有適合的內(nèi)控基因 (internal control gene) 可以做為控制組，公認(rèn)常用的內(nèi)控基因 U6 或 SNORD  RNAs 等，在個(gè)體間的表現(xiàn)也是差異很大并不適用。因此透過 Agilent Bioanalyzer 2100 的結(jié)果進(jìn)行 miRNA相對(duì)定量；或從等體積血清抽提出 miRNA 再等比例取出進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，似乎是較可信的做法，但是還是要取決于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)來決定。
 
結(jié)語       
       當(dāng)我們理解了實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)和預(yù)期可能的結(jié)果，避開了可能的干擾因素，做完芯片實(shí)驗(yàn)?zāi)玫浇Y(jié)果后，可能要先審視一下原始數(shù)據(jù)再?zèng)Q定要用那種方法來分析數(shù)據(jù)，例如；假設(shè)控制組只有表現(xiàn) 200 個(gè) miRNA，但是病人組表現(xiàn) 400 個(gè)，那經(jīng)常被使用的芯片校正方法如：median scaling 或75th percentile，可能就不適用。至于哪一種分析方式是較理想? 可能沒有標(biāo)準(zhǔn)答案，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和檢視數(shù)據(jù)來擬訂，這個(gè)說來話長，又是另一個(gè)故事了，如果有興趣的讀者可以洽詢我們的生物信息分析專業(yè)團(tuán)隊(duì)。以上是實(shí)驗(yàn)室從事血清中 miRNA 的芯片實(shí)驗(yàn)研究，所累積的一點(diǎn)小小心得，希望對(duì)正在進(jìn)行或準(zhǔn)備進(jìn)行這類研究的讀者有所幫助。
 
參考資料
(1) Wang K., et al., Comparing the MicroRNA Spectrum between Serum and Plasma. PLoS One. 2012
(2)_Huang Z., et al., Plasma microRNAs are promising novel biomarkers for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer. 2010 Jul 1;127(1):118-26.