第三節(jié) 植物病毒RNA 提取

大多植物病毒RNA 為單鏈RNA ，并且其極性與mRNA 極性相同，植物病毒RNA 提取較為簡(jiǎn)單，一般使用酚氯仿即可獲得滿(mǎn)意結(jié)果。

一、材料

提純TMV病毒液（10mg/ml）。

二、設(shè)備

冷凍臺(tái)式離心機(jī)，低溫真空干燥儀，電泳儀，電泳槽。

三、試劑

TE-飽和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液，無(wú)RNA 酶的雙菌水。

四、操作步驟

1、取一eppendorf管加入提純TMV（10mg/ml)400ml，再加入等體積酚/氯仿，蓋緊管蓋后用手充分振蕩1分鐘，4℃下12000g離心10分鐘。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有機(jī)相交界面無(wú)蛋白為止。

3、吸取水相于新eppendorf心管，加入等體積氯仿，用手倒置離心管數(shù)十秒，4℃下12000g離心10分鐘。

4、取水相，加入1/10倍體積的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻，-20℃30分鐘。

5、4℃下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下12000g離心5分鐘。

6、小心棄去上清液，沉淀真空干燥5分鐘或空氣干燥10分鐘，并溶于無(wú)RNA 酶的雙菌水或TE緩沖液中。

7、取10ml進(jìn)行電泳分析，另10ml用于cDNA合成。

[注意] 1、整個(gè)操作應(yīng)盡可能在低溫下進(jìn)行。

2、由于病毒RNA 鑲嵌于外殼蛋白里面，因此要充分剝?nèi)ゲ《就鈿さ鞍�，一般需要多次進(jìn)行酚/氯仿的抽提

cDNA合成技術(shù)

Promega公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA合成系統(tǒng)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H缺失突變株取代AMV反轉(zhuǎn)錄酶,使合成的cDNA更長(zhǎng)。該系統(tǒng)的第一鏈合成使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,cDNA第二鏈合成采用置換合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ進(jìn)行置換合成,最后用T4 DNA聚合酶切去單鏈末端,方法簡(jiǎn)便易行。該系統(tǒng)試劑包括：

20μg 特異性引物

200μl M-MLV第一鏈緩沖液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris·Cl pH8.3(37℃時(shí)); 375mmol/l KCl; 　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP混合物(各2.5mmol/L)

2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制劑

10,000μ M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶, RNase H-

5μg 對(duì)照RNA

400μl M-MLV第二鏈緩沖液(10×)，配方如下：

400mmol/L Tris·Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;

30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。

500μ RNase H

500μ DNA聚合酶Ⅰ

100μ T4 DNA聚合酶Ⅰ

2×1.25ml 不含核酸酶的水

以上所有試劑除對(duì)照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA 。

（一） 第一鏈合成

1. 試劑

[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM和200mM)，TE-飽和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE緩沖液。

2. 操作步驟

(1) 取一滅菌的無(wú)RNA 酶的eppendorf管,加入RNA 模板和適當(dāng)引物,每μg RNA 使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接頭,使用0.3μg),用H2 O調(diào)整體積至15μl, 70℃處理5分鐘,冷卻至室溫,離心使溶液集中在管底,再依次加入

5×第一鏈緩沖液 5μl

rRNasin RNA 酶抑制劑 25U

M-MLV(H- )反轉(zhuǎn)錄酶 200U

H₂O 調(diào)至總體積25μl

(2) 用手指輕彈管壁,吸取5μl至另一eppendorf管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),用以第一鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

(3) 37℃(隨機(jī)引物)或42℃(其它引物)溫浴1小時(shí)

(4) 取出置于冰上

(5) 摻入測(cè)定的eppendorf管加入95μl 50mM EDTA終止反應(yīng),并使總體積為100μl。可取90μl進(jìn)行電泳分析(先用苯酚抽提),另10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定。

第一鏈合成eppendorf管可直接用于第二鏈合成

注：以上25μl反應(yīng)總體積中所用RNA 量為1μg,如合成5μg RNA ,則可按比例擴(kuò)大反應(yīng)體積, 倒5μg RNA 使用125μl總體積進(jìn)行合成。

（二） 第二鏈合成

1、 取第一鏈反應(yīng)液 20μl, 再依次加入

10×第二鏈緩沖液 20μl

DNA聚合酶Ⅰ 23μ

RNase H 0.8μ

H2O 加至終體積為100μl

2、輕輕混勻,如需進(jìn)行第二鏈同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。

3、14℃溫浴2小時(shí)(如需合成長(zhǎng)于3kb的cDNA, 則需延長(zhǎng)至3-4小時(shí))。

4、 摻入測(cè)定eppendorf管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl進(jìn)行同位素?fù)饺敕派湫詼y(cè)定,余下的可進(jìn)行電泳分析。

5、 cDNA第二鏈合成離心管反應(yīng)液70℃處理10分鐘, 低速離心后置冰上。

6、 加入2μ T4 DNA聚合酶, 37℃溫浴10分鐘。

7、加入10μl 200mmol/L EDTA終止反應(yīng)。

8、用等體積酚:氯仿抽提cDNA反應(yīng)液,離心2分鐘。

9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍體積的7.5M醋酸銨(或0.1倍體積的1.5M醋酸鈉,pH5.2), 混勻后再加入2.5倍體積的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30分鐘后離心5分鐘。

10、 小心丟去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,離心2分鐘。

11、 小心移去上清液,干燥沉淀。

12、 沉淀溶于10-20μl TE緩沖液。

（三）同位素?fù)饺敕派湫曰钚詼y(cè)定、計(jì)算和電泳分析

1. 試劑

1mg/ml鮭魚(yú)精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，堿性瓊脂糖膠，堿性膠電泳緩沖液，（ 30mM NaOH，1mM EDTA），2×樣品緩沖液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚藍(lán)）。

2. 操作步驟

(1) 各取一2(5)中和二(4)反應(yīng)液各3μl,點(diǎn)于玻璃纖維濾紙,室溫干燥, 這些樣品代表總放射性活性。

(2) 同樣各取3μl中反應(yīng)液至含有100μl(1mg/ml)鮭魚(yú)精DNA中,混勻,加入0.5ml 5% TCA, 渦旋混合儀混合后置冰上5-30分鐘。

(3) 用玻璃纖維濾紙過(guò)濾,用冰冷的5% TCA洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗, 這些樣品代表?yè)饺敕派湫曰钚浴?

(4) 分別測(cè)定總放射性活性強(qiáng)度和摻入放射性活性強(qiáng)度,可用蓋革計(jì)算器,也可用液閃計(jì)數(shù)。

3. 第一鏈產(chǎn)量測(cè)定

第一鏈摻入率(%)= 摻入cpm/總cpm ×100%

摻入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反應(yīng)體積(μl)×(第一鏈摻入率)

設(shè)330為每mol dNTP的平均分子量

合成cDNA量(ng)=摻入dNTP (nmol)×330ng/nmol

mRNA 向cDNA轉(zhuǎn)變率=合成cDNA量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%

例如總放射性活性強(qiáng)度為254,000cpm, 摻入放射性活性強(qiáng)度為3040cpm, 所用RNA 摸板量為1μg,反應(yīng)體積為25μl, 則:

摻入率＝3040/254000×100%=1.2

摻入dNTP量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol

合成cDNA量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng

mRNA 向cDNA轉(zhuǎn)變率=198nm/1000ng×100%=19.8%

由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于摻入測(cè)定,而反應(yīng)體積占總體積80%,因而實(shí)際第一鏈cDNA合成量。