CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)入門(mén)技術(shù)手冊(cè)

——深圳百恩維生物

1、CHO細(xì)胞背景

      CHO細(xì)胞是中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國(guó)科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉(cāng)鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細(xì)胞，是目前生物工程上廣泛使用的細(xì)胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，細(xì)胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細(xì)胞。ATCC保存CHO-K1細(xì)胞株，編號(hào)為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達(dá)。由于該細(xì)胞存在遺傳缺陷，無(wú)脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?/SPAN>-γ-半醛，培養(yǎng)過(guò)程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長(zhǎng)。并且由于該細(xì)胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細(xì)胞為貼壁型細(xì)胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長(zhǎng)。

2 、CHO 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)

     由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和基因表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)與在原核生物中的表達(dá)存在較大差異，因而外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)所需的元件也不同于在原核生物細(xì)胞中的表達(dá)所需的元件。外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA 翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)的加工等過(guò)程，如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成等比較復(fù)雜，要表達(dá)具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的酶需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行。哺乳動(dòng)物基因表達(dá)宿主細(xì)胞選擇的基本原則是來(lái)源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達(dá)效果好，CHO 細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)除具有上述的特點(diǎn)要求外，還有以下優(yōu)勢(shì)：

1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒(méi)有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；

2）適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；

3）對(duì)培養(yǎng)基的要求較低，可在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

4）細(xì)胞可進(jìn)行貼壁培養(yǎng)也可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；

5）可進(jìn)行高密度大量培養(yǎng)，進(jìn)行較大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)其培養(yǎng)量可放大到20000L 以上，是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動(dòng)物基因表達(dá)受體細(xì)胞之一。

    另有研究者嘗試將類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子IGF 基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO 細(xì)胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級(jí)CHO”，無(wú)需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細(xì)胞可在無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中生長(zhǎng)良好。

3、CHO細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物源成分培養(yǎng)基

     帶血清的細(xì)胞培養(yǎng)基因?yàn)檠�清的組成具有不確定的性，可控性、重現(xiàn)性都比較差，不利于產(chǎn)業(yè)化、規(guī)�；�。而無(wú)血清無(wú)動(dòng)物源培養(yǎng)基組成確定，重現(xiàn)性、可控性都比較好，因此不管是科研客戶(hù)還是臨床治療客戶(hù)，越來(lái)越趨向于采用無(wú)血清無(wú)動(dòng)物源的培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)CHO細(xì)胞。目前, 大部分CHO細(xì)胞培養(yǎng)均可在無(wú)血清培基中進(jìn)行, 采用無(wú)血清培養(yǎng)取代傳統(tǒng)血清培養(yǎng)已成為CHO細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展必然趨勢(shì)。無(wú)血清培基已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞工程領(lǐng)域和臨床治療。

     深圳百恩維生物依托于在細(xì)胞培養(yǎng)基研發(fā)和動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)，潛心研究，開(kāi)發(fā)研制了多種個(gè)性化培養(yǎng)基，通過(guò)在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用已取得可喜的成果，如CHO細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基（BW12009）就是其中之一。

4、百恩維CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基（BW12009）的特點(diǎn)

     BW12009是深圳百恩維生物開(kāi)發(fā)的新一代CHO細(xì)胞無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分細(xì)胞培養(yǎng)基，能支持多種CHO細(xì)胞的生長(zhǎng)維持，可廣泛應(yīng)用于CHO細(xì)胞的無(wú)血清懸浮培養(yǎng)及抗體、重組蛋白、疫苗的生產(chǎn)過(guò)程。細(xì)胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗(yàn)嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理和ISO9001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

1）系無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基，化學(xué)成分明確，保證了細(xì)胞培養(yǎng)中原輔料的使用安全性；

2）支持多種CHO細(xì)胞系的生長(zhǎng)，包括貼附型與懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)，具有較為廣泛的適用性；

3）可維持CHO細(xì)胞高密度培養(yǎng)，細(xì)胞增殖速度快，適用于實(shí)驗(yàn)研究和大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用；

4）根據(jù)用戶(hù)的不同使用，可定制培養(yǎng)基，以滿(mǎn)足各種等不同系統(tǒng)的應(yīng)用需求；

5）有多種包裝規(guī)格可供選擇，滿(mǎn)足不同用戶(hù)的使用需求。

5、定制CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基

     CHO 細(xì)胞存在多種克隆細(xì)胞系，ATCC 保存的CHO 細(xì)胞就多達(dá)38 種，再加上研究單位或百恩維類(lèi)似的公司構(gòu)建的細(xì)胞，其克隆細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)不止這些。對(duì)于CHO細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)而言，由于構(gòu)建的各種高性能CHO 細(xì)胞系不同，不同克隆細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)要求也都非常的不同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求往往是個(gè)性化的。另外，CHO 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的不同培養(yǎng)階段、重組CHO 細(xì)胞株的各個(gè)階段，細(xì)胞代謝所需的營(yíng)養(yǎng)或限制因素也是不同的，即同一CHO細(xì)胞系在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程也需要使用不同的培養(yǎng)基，需要與之相對(duì)應(yīng)的個(gè)性化培養(yǎng)基。百恩維已經(jīng)為多家世界著名的生物制藥公司提供個(gè)性化的CHO 細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基。

6、CHO 細(xì)胞無(wú)血清馴化

     在含血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的 CHO 細(xì)胞可經(jīng)過(guò)一定的細(xì)胞馴化過(guò)程，適應(yīng) 細(xì)胞培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)。百恩維提供已馴化過(guò)的CHO 細(xì)胞系。如果需要，研究者也可按照以下辦法進(jìn)行CHO 細(xì)胞無(wú)血清馴化。

     已經(jīng)適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)的CHO 細(xì)胞可直接在BW12009中實(shí)現(xiàn)無(wú)血清培養(yǎng)培養(yǎng)，建議前二代的細(xì)胞密度不低于4×105cells/ml。

細(xì)胞的無(wú)血清馴化過(guò)程如下：

1. 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁 CHO 細(xì)胞，活率大于95%，開(kāi)始進(jìn)行無(wú)血清馴化。

2. 細(xì)胞馴化可以在方瓶（T-flask）、搖瓶（shake-flask）或轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進(jìn)行。

3. 將無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按 1：1（V/V）的比例進(jìn)行混合，接種密度為2－4×105cells/ml 的細(xì)胞，在37℃、5％CO2 培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

4. 根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代 1－3 代，接種密度維持在2- 4×105cells/ml。

5. 逐步提高無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過(guò)程的細(xì)胞接種密度仍維持為2- 4×105cells/ml。直至混合液中的血清濃度降低至 0.1-0.2%，每一代的細(xì)胞活率大于90％后，此時(shí)可將細(xì)胞完全培養(yǎng)在CHO 無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基中。

6. 在 CHO 無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)基中進(jìn)行放大培養(yǎng)，建立起適應(yīng)無(wú)血清無(wú)動(dòng)物組分培養(yǎng)的CHO 種子細(xì)胞庫(kù)。