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阿爾茨海默�。ˋD）是典型的老年性癡呆，腦組織內(nèi)淀粉樣蛋白β（Aβ）的累積是造成此病的主要原因，與此同時，患有AD的患者其累積的Aβ90%在腦血管壁上發(fā)現(xiàn)。眾所周知，Aβ是由可分解出兩種蛋白（β-和γ-分泌）的淀粉樣前體蛋白（APP）產(chǎn)生的，累積在腦組織內(nèi)的Aβ分子主要是由神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的APP表達產(chǎn)生，即APP695.與此相反，另一不同APP即APP770，表達于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，最新報道稱，APP770產(chǎn)生的Aβ也在腦血管壁上累積

此ELISA試劑盒用于EDTA-血漿，腦脊髓液和上清中人APP770的檢測

此試劑盒是一種夾心法的ELISA試劑盒，使用了兩種高特異性的抗體。TMB作為顯色劑，最終溶液所顯示的顏色強度與樣品中APP770的量成正比

0.10~6.2ng/mL

僅用于研究，不能用于診斷

此試劑盒用于EDTA-血漿腦脊液和細(xì)胞上清中人APP770的定量檢測

1.       微孔板，96T，包被有抗人APP OX2(351)兔子IgG抗體，親和純化

2.       標(biāo)記抗體濃縮，30X，0.4ml，HRP標(biāo)記的抗人APP（R101A4）小鼠IgG 單抗Fab片段

3.       標(biāo)準(zhǔn)品，0.5ml，2支，重組人APP770

4.       EIA緩沖液，30ml，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS

5.       標(biāo)記抗體稀釋液，12ml，1%的BSA，含0.05%的吐溫20的PBS

6.       著色劑，TMB，15ml

7.       終止液，1N硫酸，12ml

8.       洗滌緩沖濃縮液，40X，50ml，0.005%吐溫20的磷酸緩沖液

試驗所需材料但試劑盒未提供

l         酶標(biāo)儀（450nm）

l         帶刻度的量筒與燒杯

l         孵箱（37℃±1℃）

l         吸水紙

l         稀釋試管

l         微量移液器和取樣吸頭

l         去離子水

l         坐標(biāo)紙（log/log）

l         用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管

l         洗滌瓶

1.       洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完

2.       標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。

例：如果只測一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時每孔加100ul）

此步驟在實驗開始前完成

剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶內(nèi)，保存在4℃

3.       標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶內(nèi)，充分混勻，得到12.4ng/ml的人APP770標(biāo)準(zhǔn)品

4.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備8個試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號管                 6.2ng/ml

2號管                 3.1ng/ml

3號管                 1.55ng/ml

4號管                 0.78ng/ml

5號管                 0.39ng/ml

6號管                 0.19ng/ml

7號管                 0.10ng/ml

8號管                 0ng/ml（試驗樣品空白）

吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號管混勻，然后從1號管吸取230ul加入2號管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為6.2~0.10ng/ml

5.       樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋。如果樣品濃度事先沒有評估，我們建議，先用幾個不同稀釋比例的樣品進行檢測，來確定樣品最佳稀釋比例

使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測同時進行

 

試劑	檢測樣品	標(biāo)準(zhǔn)品	檢測樣品對照孔	試劑對照孔
	檢測樣品100ul	稀釋標(biāo)準(zhǔn)品（1-7管）100ul	EIA緩沖液（第8管） 100ul	EIA緩沖液100ul
蓋板，4℃下溫育過夜
洗板7次
酶標(biāo)抗體	100ul	100ul	100ul	-
蓋板，37℃下溫育30min
洗板9次
顯色劑	100ul	100ul	100ul	100ul
室溫避光溫育30min
終止液	100ul	100ul	100ul	100ul
加終止液后30min內(nèi)450nm處讀取OD值

1）  確定好空白對照孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2）  確定好樣品對照孔，檢測樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后分別將100ul樣品對照品、檢測樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。

3）  蓋板，4℃下溫育過夜

4）  用洗滌瓶洗板，在微孔中加入洗滌液浸泡15-30秒，棄去洗滌液。重復(fù)7次，最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機洗板時，用洗板機洗四次后，再用洗滌瓶洗3次。

5）  每孔加100ul酶標(biāo)抗體，除試劑空白對照孔外

6）  蓋板，37℃下溫育30min

7）  按照步驟4）洗板9次

8）  將所需量的顯色劑加入到試管中，然后在每一微孔中加入100ul顯色劑。為了避免污染，請勿將剩余試劑在倒入原裝試劑瓶中。

9）  室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會變成藍色

10）在每孔加100ul終止液，此時溶液顏色會變成黃色

11）擦去微孔板底部的污點或水滴，終止液加入后30min內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm處讀數(shù)

1.       試驗樣品采集后應(yīng)立即檢測或是凍存，凍存的樣品避免反復(fù)凍融，檢測前應(yīng)在低溫下先將其完全溶解混勻

2.       試驗樣品用EIA緩沖液稀釋

3.       試驗樣品和標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)做雙份檢測

4.       試驗樣品應(yīng)在中性PH范圍，有機溶劑的污染可能會影響檢測

5.       只能用試劑盒提供的洗滌液洗板，否則會導(dǎo)致試驗失敗

6.       吸水紙上拍干微孔板，不能擦拭

7.       TMB底物液應(yīng)貯存于黑暗處，因其對光敏感，且避免接觸金屬

8.       加入終止液后30min內(nèi)必須酶標(biāo)儀讀數(shù)

繪制曲線前，所有的數(shù)據(jù)都應(yīng)減去試驗樣品空白值，包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知的樣品。以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度在對數(shù)-對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可直接讀取未知樣品的濃度

 

附：采用全自動酶標(biāo)儀檢測，只需檢測前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對數(shù)）和計算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果

 

 

 

 

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