登革熱IgM ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(捕獲法)
登革熱IgM ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)(捕獲法)
（美國(guó)Inbios進(jìn)口原裝：DDMS-1）
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應(yīng)用范圍
DENV Detect IgM Capture ELISA是一種用來(lái)檢測(cè)人是否感染登革熱病毒的ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，它可以檢測(cè)出人血清中是否存在抗登革熱病毒源性重組抗原（DENVRA）的IgM抗體。此診斷實(shí)驗(yàn)用于有登革熱發(fā)熱或是登革熱血熱臨床癥狀的病人檢測(cè)。陽(yáng)性結(jié)果必須經(jīng)過(guò)蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）或是根據(jù)CDC疾病診斷指南確證。
用于臍帶血檢測(cè)，新生兒測(cè)試，產(chǎn)前篩查，或是普通人群篩查的實(shí)驗(yàn)特征性能還未建立。此試驗(yàn)未經(jīng)FDA明確證明可用于血液或血漿捐獻(xiàn)者的檢測(cè)。
注意：試驗(yàn)中需觀(guān)察西尼羅河或是其他病毒中的IgM是否會(huì)與登革熱試劑盒發(fā)生交叉反應(yīng)，如可能發(fā)生了交叉反應(yīng)，則視為警告狀態(tài)
前言說(shuō)明
登革熱是一種急性病毒性疾病，它主要通過(guò)埃及伊蚊傳播。登革熱在臨床上主要表現(xiàn)為：雙相熱、皮疹和造血抑制，還可表現(xiàn)出全身癥狀，如全身不適、關(guān)節(jié)痛、肌肉疼痛和頭痛，有時(shí)還可能出現(xiàn)極為罕見(jiàn)的出血性高燒，并可能導(dǎo)致致命性的休克。登革熱主要流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大概每年會(huì)發(fā)生100,000,000例。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大概會(huì)出現(xiàn)500到1000萬(wàn)例登革熱病人，同時(shí)還會(huì)出現(xiàn)250000到500000例登革熱出血熱。在2002年，據(jù)報(bào)道，30多個(gè)拉丁美洲的國(guó)家出現(xiàn)10000000例登革熱病人，并且大多數(shù)是登革熱出血熱（DHF）病人。之后在2003年到2005年，在印度的一些地方也廣泛流行DHF。在美國(guó)，據(jù)報(bào)道，DHF病人在1996到2002年就增加了三倍。據(jù)報(bào)道說(shuō)，登革熱也在夏威夷和德克薩斯州的拉雷多爆發(fā)過(guò)。由于病毒的潛在傳染性，一些病毒包括登革熱都被列為CDD的A類(lèi)潛在傳染源。Inbios公司的登革熱IgM抗體捕獲法ELISA試劑盒很適合于CDC中使用，在感染后3到5內(nèi)，原發(fā)性和繼發(fā)性病人的體內(nèi)都有可檢測(cè)到的IgM抗體水平，而且這種抗體通常可以在人體內(nèi)持續(xù)90天。
實(shí)驗(yàn)原理
DENV Detect IgM ELISA試劑盒是由一種酶聯(lián)擴(kuò)大的兩步法免疫檢測(cè)系統(tǒng)。在此實(shí)驗(yàn)中，將登革熱陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控和未知濃度的血清樣品用樣品稀釋液稀釋?zhuān)缓蠹尤氲桨涣丝谷薎gM抗體的微孔中溫育，之后分別加入登革熱源性重組抗原DENVRA和正常細(xì)胞抗原（NCA）進(jìn)行溫育。溫育并洗板后，用HRP標(biāo)記的DEN特異性抗體處理。第二次溫育并洗板后，加入TMB底物液進(jìn)行溫育。之后再加入酸性終止液，450nm處測(cè)OD值可確定底物反應(yīng)的程度。當(dāng)高于一定數(shù)值時(shí)（臨界值），樣品的吸光度值可確定樣品中是否存在登革熱抗體。
注意：陰性質(zhì)控和弱陽(yáng)性質(zhì)控以?xún)?nèi)在質(zhì)控形式提供，其目的是為了監(jiān)測(cè)試劑盒成分的完整性。
試劑盒成分
登革熱IgM ELISA試劑盒提供了足夠做96個(gè)測(cè)試所需要的試劑。試劑盒成分如下：
登革熱檢測(cè)特定材料：
1）抗人IgM包被的包被板：帶板蓋的板架，包被有抗人IgM， 96孔，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
2）樣品稀釋液：1瓶，25ml，即用，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，0.05%的Proclin防腐劑和添加劑，用于試驗(yàn)樣品，陽(yáng)性和陰性質(zhì)控的稀釋?zhuān)?-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定
3）即用型的登革熱重組性抗原（DENRA）：1瓶，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，抗生素（0.0025-0.004% G418 硫酸鹽），登革熱重組抗原和添加劑， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
4）即用型正常細(xì)胞抗原（NCA）：1支，3ml，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.05%的Proclin防腐劑，COS-1細(xì)胞的上清， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
5）登革熱陰性質(zhì)控：1支，50ul陰性血清，登革熱陰性質(zhì)控可輔助監(jiān)測(cè)試劑盒的完整性。2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
6）登革熱IgM陽(yáng)性質(zhì)控：1支，50ul含0.03%的proclin的陽(yáng)性血清，登革熱陽(yáng)性質(zhì)控可輔助監(jiān)測(cè)試劑盒的完整性。2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
7）10倍濃縮洗滌液：1瓶，120ml，含吐溫20的10倍濃縮的磷酸緩沖鹽，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
8）HRP標(biāo)記的即用型酶聯(lián)物，1瓶，6ml，HRP標(biāo)記的黃熱病毒活性單克隆抗體，含吐溫20的Tris-HCl緩沖液，＜0.01%的硫柳汞防腐劑和添加劑，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
9）Enwash：1瓶，20ml，即用，含吐溫20的磷酸緩沖鹽， 2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定
10） TMB底物液：1瓶，9ml液態(tài)底物液，即用，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：底物液必須始終儲(chǔ)存于避光試劑瓶中。
11） 終止液：1瓶，內(nèi)含6ml即用型的終止液，1N的硫酸，2-8℃下儲(chǔ)存，有效期內(nèi)穩(wěn)定。注意：強(qiáng)酸，請(qǐng)戴保護(hù)手套、口罩和安全鏡，按照安全條例處理所有的材料。
實(shí)驗(yàn)所需器材但試劑盒不提供
1）可在450nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀
2）生物學(xué)或高純度水
3）真空泵
4）洗板機(jī)
5）37℃無(wú)CO2的孵箱
6）1-10ul的單道移液器，50-200ul的單道和多道移液器。
7）聚丙烯試管
8）Parafilm封口膜
9）計(jì)時(shí)器
10） 旋渦混合器
樣品的采集與準(zhǔn)備
1）此實(shí)驗(yàn)必須用血清來(lái)做。全血和血漿樣本不能直接檢測(cè)。
2）不要將不同批次的試劑混亂
3）不要加熱熱滅活的試驗(yàn)血清
4）實(shí)驗(yàn)前將所有試劑平衡至室溫，溫度的改變會(huì)對(duì)試驗(yàn)有影響
5）避免反復(fù)凍融樣品血清
6）直接用干凈的槍頭從試劑瓶中移去試劑，不能轉(zhuǎn)移，避免污染
7）不用的板條應(yīng)立即放回至密封袋中保存
8）不要使用任何過(guò)期的試劑
9）避免試劑暴露受熱或陽(yáng)光直射
10） 有些試劑可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前一定要混勻
11） 洗滌過(guò)程不完整會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響
12） 為了減少由于孵育時(shí)間的差異而引起的漂移，建議底物液和終止液加入的時(shí)間和速度要一致
13） 避免試劑中有微生物污染，尤其是酶聯(lián)物
14） 每一次吸取試劑，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品時(shí)都應(yīng)用干凈的槍頭
實(shí)驗(yàn)步驟
將所有的試劑成分和樣品都平衡至室溫。實(shí)驗(yàn)前反復(fù)倒置以混合試劑和樣品。
試劑準(zhǔn)備：
1）1X洗滌液的配制：用生物學(xué)或高純度水將10倍濃縮型的洗滌液稀釋成1X的洗滌液。為了制備即用型的洗滌緩沖液，我們可以將120ml 10倍濃縮的洗滌液加入到1080ml蒸餾水或去離子水中，沖洗掉所有晶體，旋渦混合溶液以至所有晶體都溶解掉。制備好的洗滌液可在室溫下穩(wěn)定儲(chǔ)存6個(gè)月。使用前請(qǐng)檢查洗滌液是否被污染。
2）包被板的準(zhǔn)備：將實(shí)驗(yàn)所需數(shù)目的板條置于板架上。將剩余的板條立即裝入包裝袋中，并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，有效期內(nèi)穩(wěn)定。
操作步驟：
操作步驟：
1）陽(yáng)性質(zhì)控、陰性質(zhì)控都必須做雙份檢測(cè),DENRA和NCA都要檢測(cè)，未知血清樣品可做一份或雙份，DENRA和NCA都要檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)上的操作流程圖進(jìn)行操作。
2）將實(shí)驗(yàn)中使用的板條標(biāo)記好。
3）用試劑盒提供的樣品稀釋液將血清和質(zhì)控品稀釋100倍。用小聚丙烯試管進(jìn)行稀釋?zhuān)♂寱r(shí)至少需要4ul血清、陽(yáng)性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。如：4ul血清加396ul稀釋液。
4）用單道或多道移液器將稀釋好的血清、陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各50ul加入到相應(yīng)的微孔中。注意，所有的樣品都必須用DENRA和NCA檢測(cè)。
5）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。
注意：這樣是為了保證溫度的分布在每個(gè)孔的底部和邊緣同等地散播。一旦頂部密封阻礙了蒸發(fā)，任何多余的封板膠必需被剪掉。
6）37℃下孵育1小時(shí)。注意：不要將微孔板疊放，必須單獨(dú)地分層平輔。這對(duì)于溫度的平等分布非常重要。不要使用CO2或任何氣體，不要讓板條接觸任何濕潤(rùn)的物質(zhì)，如濕紙巾等。
7）溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
8）在A-D列中加入50ul DENRA，在E-H列中加入50ul NCA。
9）用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）
10） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）
11） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
12） 用多道移液器在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物。
13） 用封板膠僅在開(kāi)放的微孔表面封板，所有板條的底部是沒(méi)有覆蓋的。（同步驟5）
14） 37℃下孵育1小時(shí)。（同步驟6）
15） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
16） 用多道移液器在每一微孔中加入150ul Enwash溶液。
17） 室溫下溫育（無(wú)需蓋板）5min。
18） 溫育后，用洗板機(jī)洗板6次，每次每孔300ul。
19） 用多道移液器在每一微孔中加入75ul TMB底物液。
20） 室溫避光溫育10min。
21） 溫育后，用多道移液器在每一微孔中加入50ul終止液，室溫溫育1min。
22） 溫育后，450nm處測(cè) OD值。
登革熱IgM ELISA實(shí)驗(yàn)操作流程圖：
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羊抗人IgM包被的包被板 |
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將1/100比例稀釋好的陰性質(zhì)控、陽(yáng)性質(zhì)控和血清各50ul加入到相應(yīng)的微孔中 |
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在每一微孔中加入50ul 即用型的DENRA和NCA |
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37℃下溫育1h，溫育后洗板6次,300ul/孔 |
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在每一微孔中加入50ul HRP標(biāo)記的酶聯(lián)物 |
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37℃下溫育1h，溫育后洗板6次 |
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37℃下溫育1h，溫育后洗板6次 |
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在每一微孔中加入75ul TMB底物液 |
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室溫避光溫育10min |
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在每一微孔中加入50ul終止液 |
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在每一微孔中加入150ul Enwash溶液，室溫溫育5min。之后用洗滌液洗板6次 |
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酶標(biāo)儀450nm處讀取OD值 |
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室溫溫育1min |
質(zhì)量控制
每一試劑中均含有陰性和陽(yáng)性質(zhì)控血清，這些質(zhì)控可接受的免疫指數(shù)（ISR）值會(huì)在以下的詳細(xì)表格中說(shuō)明，陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控是用于監(jiān)測(cè)試劑的實(shí)質(zhì)性錯(cuò)誤，陽(yáng)性質(zhì)控并不保證試劑臨界值的精確性。如果任一質(zhì)控的ISR值不符合說(shuō)明書(shū)，則本次實(shí)驗(yàn)是無(wú)效的必須重做，如果實(shí)驗(yàn)是無(wú)效的，病人的結(jié)果不能公布。質(zhì)量控制的執(zhí)行必須與地方的，國(guó)家的或聯(lián)盟規(guī)則要求和你實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制程序標(biāo)準(zhǔn)相一致，建議使用者參照NCCLS C24A和42CFR493、1256作為質(zhì)量控制實(shí)踐的指引。以下的結(jié)果僅作為例子。
陰性質(zhì)控的計(jì)算：計(jì)算DENRA和NCA的登革熱病毒陰性質(zhì)控值。
例如：登革熱陰性質(zhì)控
DENRA NCA
No 1 0.108 0.066
No 2 0.082 0.061
總和 0.190 0.127
平均值（DENRA）= 0.190÷2 = 0.095
（NCA） = 0.127 ÷ 2 = 0.064
計(jì)算DENRA/NCA的比例： 0.095÷0.064 = 1.48
登革熱陰性質(zhì)控的計(jì)算DENRA/NCA比例高于1.65，則實(shí)驗(yàn)必須重做。
陽(yáng)性質(zhì)控的計(jì)算：計(jì)算NCA和DENRA的登革熱IgM陽(yáng)性質(zhì)控。
例如：登革熱陽(yáng)性質(zhì)控
DENVRA NCA
No 1 0.635 0.105
No 2 0.655 0.115
總和 1.290 0.220
平均值（DENVRA）= 1.290÷2 = 0.645
（NCA） = 0.220 ÷ 2 = 0.110
計(jì)算DENVRA/NCA的比例： 0.645÷0.110 = 5.86
登革熱陰性質(zhì)控的計(jì)算DENVRA/NCA比例低于5.0，則實(shí)驗(yàn)必須重做。
為了能出具實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須滿(mǎn)足下列表格的要求。如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能完全滿(mǎn)足下列要求，則說(shuō)明試劑退化了或者實(shí)驗(yàn)步驟出現(xiàn)了問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)必須重做。
表1：
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因素 |
可接受范圍 |
|
DENRA中登革熱陰性質(zhì)控的平均OD值 |
＜0.300 |
|
DENRA中登革熱陽(yáng)性質(zhì)控的平均OD值 |
＞0.350 |
|
登革熱IgM陽(yáng)性質(zhì)控的ISR |
＞5.000 |
|
登革熱IgM陰性質(zhì)控的ISR |
＜1.650 |
結(jié)果計(jì)算:
ISR值的計(jì)算：如果樣品是做雙份檢測(cè)，計(jì)算DENRA兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均OD值，計(jì)算NCA兩個(gè)陰性質(zhì)控的平均OD值，并計(jì)算DENVRA/NCA的比率(ISR)。如果未知樣品只做了一份，直接用DENVRA OD值除以NCA OD值
選擇臨界值和確定可疑范圍：109個(gè)真陽(yáng)性和97個(gè)真陰性樣品用于優(yōu)化ISR臨界值，建立可疑范圍�？梢煞秶蓛蓚�(gè)臨界值決定，ISR≥2.84的為陽(yáng)性，相應(yīng)的特異性為99%，靈敏度為91%；ISR≤1.65的為陰性，相應(yīng)的特異性為96%，靈敏度為94%，可疑范圍為1.65-2.84.
結(jié)果說(shuō)明
表2：:
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ISR |
結(jié)果 |
說(shuō)明 |
|
≤1.65 |
陰性 |
沒(méi)有可檢測(cè)到的IgM抗體，這結(jié)果不能排除登革熱感染。如果懷疑有早期感染，就應(yīng)該在7-14天內(nèi)對(duì)另外的樣品進(jìn)行檢測(cè)。其它登革熱測(cè)試方法也應(yīng)用來(lái)排除急性感染。 |
|
1.65-2.84 |
可疑 |
可疑樣品應(yīng)重復(fù)檢測(cè)。重復(fù)檢測(cè)后如果結(jié)果還是可疑，就應(yīng)用另外的方法來(lái)測(cè)試，或采集另一個(gè)樣品。 |
|
≥2.84 |
陽(yáng)性 |
說(shuō)明樣品中存在可檢測(cè)到的IgM抗體，建議做證實(shí)實(shí)驗(yàn)。 |
期望值
疫區(qū)人群
此登革熱IgM檢測(cè)試劑盒在2009年被南美的一間診所用于檢測(cè)有登革熱癥狀人群的血清樣本.被篩查的66位個(gè)體在起初都有發(fā)燒的癥狀.樣本中包含有初次和二次的感染.樣本的反應(yīng)關(guān)系見(jiàn)下面表3和表4.
表3：疫區(qū)人群患者的期望值
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|
|
|
檢測(cè)結(jié)果 | |||
|
年齡 |
男性人數(shù) |
女性人數(shù) |
無(wú)反應(yīng)人數(shù) |
可疑人數(shù) |
反應(yīng)人數(shù) |
流行率 |
|
9-20 |
3 |
10 |
12 |
0 |
1 |
7.7% |
|
21-30 |
5 |
7 |
8 |
1 |
3 |
25% |
|
31-40 |
6 |
14 |
13 |
2 |
5 |
25% |
|
41-50 |
7 |
6 |
9 |
2 |
2 |
15.4% |
|
51-60 |
2 |
3 |
3 |
0 |
2 |
40% |
|
61-70 |
2 |
0 |
2 |
0 |
0 |
0% |
|
71-80 |
1 |
0 |
1 |
0 |
0 |
0% |
|
總共 |
26 |
40 |
48 |
5 |
13 |
19.7% |
a:所有反應(yīng)的樣品都經(jīng)PRNT驗(yàn)證
非疫區(qū)人群
2004年3月期間,從佛羅里達(dá)州, 德克薩斯州, 賓夕法尼亞州收集無(wú)登革熱癥狀的200份血清樣本.樣本覆蓋男女的不同年齡階段.被篩選的血清反應(yīng)性見(jiàn)下表4
表4：非疫區(qū)無(wú)登革熱癥狀人體的期望值
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|
檢測(cè)結(jié)果 | |||
|
年齡 |
男性人數(shù) |
女性人數(shù) |
無(wú)反應(yīng)人數(shù) |
可疑人數(shù) |
反應(yīng)人數(shù) |
流行率 |
|
10-20 |
5 |
13 |
18 |
0 |
0 |
0.0% |
|
21-30 |
38 |
30 |
68 |
0 |
0 |
0.0% |
|
31-40 |
27 |
38 |
64 |
1 |
0 |
0.0% |
|
41-50 |
23 |
20 |
42 |
0 |
1a |
2.3% |
|
51-60 |
5 |
1 |
6 |
0 |
0 |
0.0% |
|
總共 |
98 |
102 |
198 |
1 |
1 |
0.5% |
a:此樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證為登革熱陽(yáng)性
性能特征
世界衛(wèi)生組織調(diào)研表
用于熱帶病和兒童登革熱研究和培訓(xùn)的詳細(xì)參考表由聯(lián)合國(guó)國(guó)際兒童緊急基金會(huì)/聯(lián)合國(guó)開(kāi)發(fā)中心/世界銀行/世界衛(wèi)生組織共同提供的.由提供血清樣本的七間實(shí)驗(yàn)室共同出編制.
其中一張用登革熱IgM ELISA檢測(cè)試劑盒篩查實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表是在波多黎各的病控中心完成,具體見(jiàn)表5
表5：WHO參考樣品的反應(yīng)性
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種類(lèi) |
檢測(cè)數(shù) |
檢測(cè)結(jié)果 |
合計(jì) |
種類(lèi) |
檢測(cè)數(shù) |
檢測(cè)結(jié)果 |
合計(jì) |
|
登革熱IgM陰性 |
27 |
陰性 |
27 |
系統(tǒng)性紅斑狼瘡 |
2 |
陰性 |
1 |
|
可疑 |
0 |
可疑 |
1 | ||||
|
陽(yáng)性 |
0 |
陽(yáng)性 |
0 | ||||
|
登革熱IgM陽(yáng)性 |
109 |
陰性 |
4 |
萊姆IgG |
9 |
陰性 |
9 |
|
可疑 |
5 |
可疑 |
0 | ||||
|
陽(yáng)性 |
100 |
陽(yáng)性 |
0 | ||||
|
西尼羅河病毒IgG |
11 |
陰性 |
10 |
類(lèi)風(fēng)濕因子 |
10 |
陰性 |
10 |
|
可疑 |
1 |
可疑 |
0 | ||||
|
陽(yáng)性 |
0 |
陽(yáng)性 |
0 | ||||
|
西尼羅河病毒IgM |
25 |
陰性 |
21 |
系統(tǒng)性紅斑狼瘡 |
2 |
陰性 |
2 |
|
可疑 |
2 |
可疑 |
0 | ||||
|
陽(yáng)性 |
2 |
陽(yáng)性 |
0 | ||||
|
黃熱IgM |
4 |
陰性 |
3 |
漢坦病毒IgM |
7 |
陰性 |
7 |
|
可疑 |
1 |
可疑 |
0 | ||||
|
陽(yáng)性 |
0 |
陽(yáng)性 |
0 |
陽(yáng)性率和陰性率制成表格形式，最差的情況就是，可疑樣品對(duì)于陽(yáng)性率來(lái)說(shuō)是假陰性，而可疑樣品對(duì)于陰性率來(lái)說(shuō)卻是假陽(yáng)性。
陽(yáng)性比率：(100/109) 91.7% (95% CI: 84.9-95.8%)
陰性比率：(90/97) 92.8% (95% CI: 85.6-96.7%)
臨床研究
研究中心1：
此研究采用了一系列具有登革熱癥狀的血清樣本.在規(guī)定的時(shí)期內(nèi)收集預(yù)定所需的樣本數(shù).197位個(gè)體的血清均取自東南亞的一些實(shí)驗(yàn)室,各取雙份(1至2周內(nèi)收集,共394份)經(jīng)實(shí)驗(yàn)室證明感染有登革熱的血清樣本.所有的個(gè)體在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)不同的檢測(cè)方法(包括,PCR, IgG滴定等)確定為陽(yáng)性結(jié)果.
以上所獲的樣本均用InBios公司提供的登革熱IgM ELISA試劑盒檢測(cè).以發(fā)燒持續(xù)天數(shù)作為函數(shù)的陰性和陽(yáng)性結(jié)果具體如下表.
表6：研究中心1的結(jié)果
|
發(fā)熱持續(xù)天數(shù) |
陽(yáng)性率 |
陰性率 |
可疑樣品但最終診斷為陽(yáng)性的數(shù) |
可疑樣品但最終診斷為陰性的數(shù) |
|
2-3天 |
28.6%（2/7） |
100.0%(4/4) |
1 |
0 |
|
4-5天 |
40.3%(27/67) |
78.8%(26/33) |
19 |
7 |
|
6-7天 |
75.9%(63/83) |
88.6%(31/35) |
14 |
3 |
|
8-10天 |
88.8%(71/80) |
97.1%(33/34) |
7 |
1 |
|
11-15天 |
91.7%(22/24) |
100.0%(21/21) |
2 |
0 |
|
16-19天 |
100.0%(5/5) |
100.0%(1/1) |
0 |
0 |
注意：陽(yáng)性率和陰性率制成表格形式，最差的情況就是，可疑樣品對(duì)于陽(yáng)性率來(lái)說(shuō)是假陰性，而可疑樣品對(duì)于陰性率來(lái)說(shuō)卻是假陽(yáng)性。
研究中心2：
究所采集的具有登革熱癥狀的212個(gè)體樣本均來(lái)自美國(guó)西部.2008-2009年度在規(guī)定的時(shí)期收集到預(yù)定所需的樣本.其中大部分的樣品來(lái)自加勒比海和美國(guó)德克薩斯州和佛羅里達(dá)州.另外小部分的樣品來(lái)自非洲和亞洲.檢測(cè)的212份樣本中,116份為陰性,67份為陽(yáng)性,29份為可疑樣本.可疑樣本按說(shuō)明書(shū)的規(guī)定重測(cè)后,有13份為陰性,5份為陽(yáng)性,11份仍為可疑樣本.
由于樣本量和樣本的獲取等各種原因,只有PRNT檢測(cè)了其中11份可疑樣本中的5份(其中3份為陽(yáng)性),72份陽(yáng)性樣本中的70份(62份為陽(yáng)性). 另共有130份樣本不是用PRNT篩查,而是在疾控中心用CDC Dengue MAC ELISA檢測(cè),共有9份不確定,4份可疑.再用PRNT重測(cè),其中9份不確定樣本中有3份是陽(yáng)性,4份可疑樣本中有2份為陽(yáng)性. PRNT and CDC MAC ELISA具體統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表7b.其中CDC MAC ELISA的13份可疑或不確定樣本由PRNT分類(lèi).
表7a：反應(yīng)樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證的結(jié)果
|
|
|
最終結(jié)果經(jīng)PRNT驗(yàn)證 | ||
|
|
|
陽(yáng)性樣品數(shù) |
陰性樣品數(shù) |
總共樣品數(shù) |
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
62 |
8 |
70 |
|
可疑 |
3 |
2 |
5 | |
|
陰性 |
4 |
3 |
7 | |
|
總共 |
69 |
13 |
82 | |
表7b：反應(yīng)樣品經(jīng)CDC MAC Elisaa驗(yàn)證
|
|
|
最終結(jié)果經(jīng)CDC MAC Elisaa驗(yàn)證 | ||
|
|
|
陽(yáng)性樣品數(shù) |
陰性樣品數(shù) |
總共樣品數(shù) |
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
1 |
1 |
2 |
|
可疑 |
1 |
5 |
6 | |
|
陰性 |
4 |
118 |
122 | |
|
總共 |
6 |
124 |
130 | |
a: CDC MAC中的13個(gè)樣品仍為不確定或是可疑，最終經(jīng)PRNT驗(yàn)證劃分
陽(yáng)性和陰性率的計(jì)算由PRNT和CDC MAC數(shù)據(jù)共同決定
陽(yáng)性率：(63/75) 84.0% (95% CI: 73.9-90.8%)
陰性率：(121/137) 88.3% (95% CI: 81.8-92.8%)
研究中心3：
登革熱IgM Capture ELISA試劑盒特異性的評(píng)估在美國(guó)中西部的一間公共健康實(shí)驗(yàn)室完成.此項(xiàng)研究采用了289份有登革熱癥狀樣本(2005-2008年期間收集) (其中136位個(gè)體并發(fā)患有西尼羅河病毒, 甲型肝炎,乙型肝炎,HIV, 落磯山斑點(diǎn)熱(RMSF), 軍團(tuán)病或萊姆病).所有的檢測(cè)和診斷都在公共健康實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成.所有的樣本均采自沒(méi)有爆發(fā)過(guò)登革熱疫性的美國(guó)中西部.基于這種歷史條件,因此所有個(gè)體均可認(rèn)為無(wú)登革熱病毒攜帶者.
經(jīng)過(guò)第一次的檢測(cè)和可疑樣本的重測(cè),最終得到215份樣本為陰性,22份仍為可疑.52份樣本為陽(yáng)性.74份(包括陽(yáng)性的和可疑)樣本均用PRNT重測(cè)過(guò),發(fā)現(xiàn)最終的交叉反應(yīng)的原因歸咎于西尼羅河病毒.
表8：美國(guó)無(wú)疫情的樣品檢測(cè)結(jié)果
|
|
最終診斷 | |||
|
陰性，無(wú)其他疾病 |
陰性，伴隨其他疾病 |
PRNT陽(yáng)性a | ||
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
1 |
40b |
11 |
|
可疑 |
0 |
16b |
6 | |
|
陰性 |
100 |
115 |
0 | |
|
總共 |
101 |
171 |
17 | |
a:所有登革熱PRNT檢測(cè)到的陽(yáng)性樣品的滴定量較低，被認(rèn)定為是西尼羅河陽(yáng)性血清，表明可能與登革熱PRNT發(fā)生了交叉反應(yīng)
b:注意：所有的假陽(yáng)性和大量的可疑樣品僅僅是因?yàn)榕c西尼羅河陽(yáng)性樣品間的交叉反應(yīng)
樣本可能會(huì)依據(jù)個(gè)人病情而進(jìn)一步細(xì)分，例如，西尼羅河病毒的陽(yáng)性個(gè)體可能與登革熱試劑盒發(fā)生了交叉反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)下表
表9：上述疑似發(fā)生了交叉反應(yīng)的樣品檢測(cè)結(jié)果
無(wú)其他疾病的陰性率：(100/101) 99.0% (95% CI: 94.1-100%)
除了西尼羅河病毒外地伴隨疾病的陰性率：(35/35) 100% (95% CI: 88.2-100%)
西尼羅河病毒的陰性率：(80/136) 58.8% ((95% CI: 50.4-66.7%)
35位個(gè)體未患有登革熱樣本(其中5份患有落磯山斑點(diǎn)熱(RMSF),2份患有軍團(tuán)病,2份患有萊姆病,8份患有HIV,2份甲型肝炎,5份患有乙型肝炎,11份患有丙型肝炎)經(jīng)InBios 登革熱IgM
Capture ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)沒(méi)有一份表現(xiàn)為陽(yáng)性或可疑.
在136位個(gè)體未患有登革熱樣本但攜帶有西尼羅河病毒的樣本中,80份為陰性,16份為可疑,40份為陽(yáng)性.
研究中心4
登革熱IgM Capture ELISA試劑盒特異性的評(píng)估是在美國(guó)南部的一間健康中心進(jìn)行的.此次評(píng)估用了199份(從2004-2008期間收集)認(rèn)為無(wú)登革熱癥狀的樣本.大部分的病患有頭痛或發(fā)燒的癥狀,其他都表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)方面的癥狀.初次檢測(cè),183份樣本為陰性,10份為可疑,10可疑樣本經(jīng)重測(cè)后,其中有6份被檢測(cè)為陽(yáng)性. 再重測(cè)一次,10份可疑樣本均為陰性.
這199份樣本進(jìn)一步用疾控中心用CDC Dengue IgM (MAC) ELISA檢測(cè)試劑盒重測(cè),分類(lèi)為陽(yáng)性,陰性,可疑,不可解釋.最終發(fā)現(xiàn)有16份樣本為無(wú)法解釋樣本. 這些可疑樣本用PRNT測(cè)則為陰性.如下表如示,用CDC Dengue IgM ELISA試劑盒檢測(cè),總有1份樣本可疑,1份陽(yáng)性.
表10：無(wú)疫情區(qū)的登革熱樣品檢測(cè)結(jié)果
|
|
CDC登革熱IgM（MAC）elisa | |||
|
登革熱陽(yáng)性樣品 |
登革熱可疑樣品 |
登革熱陰性樣品 | ||
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
0 |
0 |
6 |
|
可疑 |
0 |
0 |
0 | |
|
陰性 |
1 |
1 |
191 | |
|
總共 |
1 |
1 |
197 | |
陰性率：(191/197) 97.0% (95% CI: 93.4-98.7%)
研究中心5：
此次探究性研究采用55位具有癥狀表現(xiàn)的個(gè)體樣本(平均年齡在35.1年,樣本收集于2009年)均來(lái)自南美登革熱疫區(qū).樣本的2次訪(fǎng)問(wèn)收集是在4-14天(平均9天)采集,樣本均用登革熱IgM Capture ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè).可疑樣本用同樣的試劑盒重測(cè).同時(shí)用PRNT方法驗(yàn)證第1次和第2次訪(fǎng)問(wèn)的人群.在第1次和第2次之間訪(fǎng)問(wèn)樣本的PRNT 4倍增長(zhǎng)值表明有39位個(gè)體當(dāng)前具有登革熱癥狀.
表11：第一次訪(fǎng)問(wèn)采集的無(wú)疫情區(qū)的樣品檢測(cè)結(jié)果a
|
|
最終診斷 | ||
|
近期感染樣品b |
近期感染但無(wú)癥狀樣品c | ||
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
13 |
0 |
|
可疑 |
4 |
1 | |
|
陰性 |
22 |
15 | |
|
總共 |
39 |
16 | |
陰性率：(15/16) 93.8% (95% CI: 69.7-100%)
b:PRNT陽(yáng)性且第一次和第二次收集的樣品之間增加值大于4倍
c:PRNT陽(yáng)性且第一次和第二次之間增加值小于4倍
第二次訪(fǎng)問(wèn)個(gè)體(4-14天)的血清樣本的結(jié)果如下表所示,檢測(cè)的靈敏度隨第二次訪(fǎng)問(wèn)的時(shí)間間隔而增加.
表12：第二次訪(fǎng)問(wèn)采集的無(wú)疫情區(qū)的樣品檢測(cè)結(jié)果
|
|
最終診斷 | ||
|
近期感染樣品b |
近期感染但無(wú)癥狀樣品c | ||
|
檢測(cè)結(jié)果 |
陽(yáng)性 |
31 |
1 |
|
可疑 |
2 |
0 | |
|
陰性 |
6 |
15 | |
|
總共 |
39 |
16 | |
a:陽(yáng)性率：(31/39) 79.5% (95% CI: 64.2-89.5%)
陰性率：(15/16) 93.8% (95% CI: 69.7-100%)
b:PRNT陽(yáng)性且第一次和第二次之間增加值大于4倍
c:PRNT陽(yáng)性且第一次和第二次之間增加值小于4倍
如“結(jié)果解釋”部分提到的，可疑樣品應(yīng)進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如果還是可疑樣品則需送去認(rèn)證測(cè)試
回收率研究
五天內(nèi)在不同的三個(gè)地點(diǎn),兩個(gè)不同的操作者完成對(duì)登革熱 IgM Capture ELISA檢測(cè)試劑盒可重現(xiàn)性研究實(shí)驗(yàn)的評(píng)估.樣本(包括質(zhì)控)均同時(shí)采用三份檢測(cè).實(shí)驗(yàn)分別在佛羅里達(dá)州一間公共健康實(shí)驗(yàn)室, InBios,美國(guó)中部的一家實(shí)驗(yàn)室.此次研究實(shí)驗(yàn)采用4份血清樣本(均按照相關(guān)規(guī)定稀釋).包括一份陰性樣本,一份剛低于可疑范圍的樣本,一份可疑樣本,一份陽(yáng)性樣本.血清樣本的稀釋均符合臨床相關(guān)要求檢測(cè)的濃度范圍.具體結(jié)果見(jiàn)下表.
表13：inbiosa公司登革熱試劑盒的再現(xiàn)性
|
|
|
|
板間試驗(yàn) |
不同的時(shí)間 |
不同的操作者 |
不同的地點(diǎn) |
合計(jì) | |||||
|
樣品 |
N |
ISR平均值 |
Swr |
%CVwr |
SOD |
%CVOD |
SOO |
%CVOO |
Sss |
%CVss |
ST |
%CVT |
|
板A |
90 |
1.133 |
0.148 |
13.06 |
0.056 |
4.96 |
0.066 |
5.86 |
0.064 |
5.63 |
0.158 |
13.97 |
|
板B |
90 |
1.587 |
0.245 |
15.41 |
0.187 |
11.79 |
0.182 |
11.44 |
0.081 |
5.11 |
0.308 |
19.40 |
|
板C |
90 |
2.433 |
0.621 |
25.52 |
0.668 |
27.46 |
0.522 |
21.44 |
0.207 |
8.52 |
0.912 |
37.49 |
|
板D |
90 |
5.821 |
1.18 |
20.28 |
2.014 |
34.59 |
1.072 |
18.41 |
0.693 |
11.91 |
2.334 |
40.10 |
|
陽(yáng)性質(zhì)控 |
90 |
11.944 |
1.692 |
14.17 |
2.437 |
20.40 |
2.085 |
17.46 |
1.546 |
12.94 |
2.967 |
24.84 |
|
陰性質(zhì)控 |
90 |
1.148 |
0.152 |
13.25 |
0.088 |
7.67 |
0.064 |
5.61 |
0.051 |
4.47 |
0.176 |
15.31 |
所有值都用DENRA/NCA比值計(jì)算
Sx=標(biāo)準(zhǔn)劃分，如wr是板間試驗(yàn)，DD不同天地試驗(yàn)，OO不同操作者的試驗(yàn)，SS不同地點(diǎn)的試驗(yàn)
CV=變異系數(shù)
交叉反應(yīng)研究
用登革熱 IgM Capture ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)帶有幾種疾病(見(jiàn)下表)的血清樣本.樣本均采用雙份檢測(cè).檢測(cè)得到陽(yáng)性和可疑性的樣本采用一式三份重測(cè).用血小板減少中和反應(yīng)檢測(cè)陽(yáng)性樣本是為了評(píng)估登革熱病毒的可暴露性.明顯的交叉反應(yīng)只在西尼羅河病毒中觀(guān)察到。
表14：交叉反應(yīng)
|
疾病或致病原 |
樣品數(shù) |
DENV Detect IgM ELISA |
可疑和陽(yáng)性樣品合計(jì) |
陽(yáng)性或可疑率 | |
|
| |||||
|
可疑 |
陽(yáng)性 | ||||
|
東部馬腦炎a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
乙腦a |
2 |
0 |
0 |
0/2 |
0% |
|
圣路易型腦炎a |
4 |
0 |
0 |
0/4 |
0% |
|
乙型肝炎a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
EB病毒a |
15 |
0 |
0 |
0/15 |
0% |
|
類(lèi)風(fēng)濕因子a |
7 |
0 |
0 |
0/7 |
0% |
|
丙型肝炎a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
巨型細(xì)胞病毒a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
核抗體a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
水痘帶狀皰狀病毒a |
10 |
0 |
0 |
0/10 |
0% |
|
萊姆病a |
5 |
0 |
0 |
0/5 |
0% |
|
鉤端螺旋體a,b |
11 |
0 |
0 |
0/11 |
0% |
|
西尼羅河a |
24 |
4 |
8 |
12/24 |
50% |
|
合計(jì) |
112 |
4 |
8 |
12/128 |
9.4% |
b:PRNT試驗(yàn)中，鉤端螺旋體樣品與登革熱酶免試驗(yàn)發(fā)生反應(yīng)，呈陽(yáng)性（表格中不包括此結(jié)果，因?yàn)樗皇钦骊?yáng)性樣品）
除掉三份血清樣品（一份西尼羅河陽(yáng)性，一份乙腦陽(yáng)性和一份鉤端螺旋體陽(yáng)性）的其他128份樣品經(jīng)PRNT驗(yàn)證后為陽(yáng)性，24份篩查出的陽(yáng)性或可疑樣品經(jīng)登革熱ELISA重測(cè)后，有12份西尼羅河陽(yáng)性樣品，與西尼羅河的交叉反應(yīng)率為50%。
干擾研究：
四種干擾物質(zhì)對(duì)登革熱酶免試驗(yàn)的影響。一份登革熱陰性和四份登革熱陽(yáng)性樣品根據(jù)弱陽(yáng)性到強(qiáng)陽(yáng)性依次排列。四種干擾物質(zhì)為膽紅素，甘油三酯，血紅蛋白，膽固醇。膽紅素不會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生影響，高濃度的甘油三酯對(duì)弱陽(yáng)性血清有輕微影響，增大ISR值，血紅蛋白的高濃度和低濃度都會(huì)降低ISR值，膽固醇的重復(fù)研究可得出多個(gè)結(jié)果，結(jié)果顯示膽固醇的兩個(gè)濃度都會(huì)影響DENRA的OD值，下表是相對(duì)于參考樣品，加入干擾物質(zhì)后ISR值的改變率
表15：加入干擾底物后ISR值的改變率
|
|
質(zhì)控
ISR值 |
膽紅素
|
甘油三酯 |
血紅蛋白 |
膽固醇 | ||||
|
|
|
1mg/dL |
2mg/dL |
500
mg/dL |
3000
mg/dL |
1600
mg/dL |
16000
mg/dL |
300
mg/dL |
500
mg/dL |
|
陽(yáng)性質(zhì)控 |
20.84 |
16.4% |
-1.0% |
-1.7% |
9.8% |
-67.2% |
-80.6% |
21.8% |
-1.9% |
|
陰性質(zhì)控 |
1.18 |
-1.0% |
-4.8% |
-0.4% |
7.2% |
-1.3% |
3.7% |
7.0% |
29.4% |
|
樣品D |
14.40 |
-0.9% |
-2.6% |
20.8% |
31.6% |
-43.5% |
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