德國(guó)IBL進(jìn)口原裝，酶標(biāo)儀定量檢測(cè)

 

中國(guó)SFDA注冊(cè)：國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2011第2400471號(hào)

【產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)】SFDA(I)20112400471

 

    本試劑盒為體外測(cè)定試劑盒，用酶聯(lián)免疫法定量測(cè)定濾紙片上干燥血標(biāo)本中的促甲狀腺素（hTSH），作為新生兒先天性甲狀腺機(jī)能減退癥（簡(jiǎn)稱“甲低”）的篩查。

     先天性“甲低”是以外周血甲狀腺激素（T3和T4）水平降低為特征的新生兒內(nèi)分泌障礙。世界范圍內(nèi)先天性“甲低”的平均發(fā)病率為1：4，000。此疾病特點(diǎn)是外周血中甲狀腺激素低于正常水平，而促甲狀腺素高于正常水平。人的促甲狀腺素是由腦垂體前葉合成分泌的。他調(diào)節(jié)和刺激甲狀腺產(chǎn)生甲狀腺激素。甲狀腺激素缺乏刺激hTSH分泌，存在負(fù)反饋。hTSH水平也受下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素的影響。因此，新生兒外周血促甲狀腺素濃度提高，可作為篩查判斷先天性“甲低”的根據(jù)。

     新生兒出生前后時(shí)期和出生后幾個(gè)月內(nèi)甲狀腺激素的不足將妨礙其大腦的正常發(fā)育，其最終結(jié)果是導(dǎo)致不可修復(fù)的大腦功能障礙和骨骼神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。早期篩查出新生兒先天性“甲低”，用甲狀腺激素的替代治療可防止大腦的發(fā)育不良。

1．新生兒促甲狀腺激素酶聯(lián)免疫測(cè)定法（Neonatal hTSH EIA）是一種固相雙位點(diǎn)酶免疫測(cè)定法，濾紙片上干燥血標(biāo)本洗提出hTSH，同時(shí)與包被在酶標(biāo)板上抗hTSH的單克隆分子和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗hTSH亞單位的第二抗體結(jié)合。

2．過(guò)剩的酶結(jié)合物和未結(jié)合的hTSH被洗滌去掉，加入四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物溶液進(jìn)行酶反應(yīng)。

3．加入1N硫酸（H₂SO₄）溶液終止酶反應(yīng)，用酶標(biāo)讀數(shù)儀在450nm下測(cè)定吸光度值。

試劑盒貯存在+2—+8℃。

不要使用過(guò)期試劑。

試劑盒使用前，所有試劑及酶標(biāo)板放置+18—+25℃平衡30分鐘。

TMB底物是光敏感性的，應(yīng)避免光照。

所有試劑組份一旦開啟，密封袋或蓋子緊緊密封。

1    抗-hTSH包被的反應(yīng)板                           10塊（12×8孔）

2    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮100X）   2.5ml

3    酶結(jié)合物稀釋液                                     250ml

4a   TMB顯色劑(25X)                                9.5ml

4b   底物緩沖液                                     250ml

5    洗滌液（濃縮10X）                             220ml

6    hTSH標(biāo)準(zhǔn)品                                    1張5套，每套6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，用錫箔袋包裝。

每批標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值是不相同的，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。

7    hTSH質(zhì)控 C1-C2                       1張5套，含2個(gè)質(zhì)控，用錫箔袋包裝。

每批質(zhì)控的數(shù)值是不相同的，每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。

8 終止液 0.45M 硫酸

     酶標(biāo)反應(yīng)板的塑料粘膠貼                         10張

     質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品的TSH數(shù)值表                       1張

 

 

 

 

 

 

表1      試劑的準(zhǔn)備

試劑	準(zhǔn)備	開啟或稀釋后的穩(wěn)定性（+2—+8℃）
1    抗-hTSH包被的反應(yīng)板	直接使用	2個(gè)月
2    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物（濃縮）	臨用前，用酶結(jié)合物稀釋液按1：100（1+99）稀釋配制。（見表2）	5個(gè)月 廢棄未用完的酶結(jié)合物溶液
3    酶結(jié)合物稀釋液	供配制酶結(jié)合物溶液用	10個(gè)月
4    底物溶液	臨用前，用底物緩沖液（4b）按1：25（1+24）將TMB顯色劑（4a）稀釋成底物溶液。	廢棄未用完的底物溶液
4a   TMB顯色劑	直接供配制底物溶液用	6個(gè)月
4b   底物緩沖液	直接供配制底物溶液用	6個(gè)月
5    洗滌液（濃縮）	用蒸餾水按1：10（1+9）稀釋	6個(gè)月 廢棄有渾濁的洗滌液
6    hTSH標(biāo)準(zhǔn)品	直接使用	3個(gè)月
7           hTSH質(zhì)控 8           終止液	直接使用 直接使用	3個(gè)月 6個(gè)月

 

表2酶結(jié)合物和底物溶液的準(zhǔn)備配制

酶標(biāo)板數(shù)（塊）	酶結(jié)合物（2） （ml）	酶結(jié)合物稀釋液（3）（ml）	TMB-顯色劑（4a）（ml）	底物緩沖液（4b）（ml）
1	0.24	24	1	24
2	0.42	42	2	48
3	0.62	62	3	72
4	0.82	82	4	96
5	1.00	100	5	120
6	1.20	120	6	144
7	1.38	138	7	168
8	1.58	158	8	192
9	1.76	176	9	216
10	2.00	200	10	240

 

蒸餾水；量筒；試劑瓶；加樣槍；吸水紙；計(jì)時(shí)器；橡膠手套

—酶標(biāo)讀數(shù)儀  如芬蘭Labsystems Multiskan

—板的振蕩器  如芬蘭Labsystems iEMS Incubator/Shaker

—洗板機(jī)      如芬蘭Labsystems Multiwash

—8-道加液器（50—300μl）

—（3mm）打孔器

 

     嬰兒出生后3—5天，用濾紙從嬰兒的足跟取一滴血液，獲得帶血點(diǎn)（直徑0.8cm）的濾紙片，并確信濾紙片被血樣完全浸透，帶血樣的濾紙片至少晾干2小時(shí)，帶血樣的干燥濾紙片（密封）在+4--+8℃至少可貯存4個(gè)月時(shí)間。

     濾紙片標(biāo)本的收集一定是單一的一滴血液，否則會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。這一滴血在濾紙片上擴(kuò)展的面積要足夠大，保證血液從濾紙的上面均勻浸透到下面，浸透不完全會(huì)造成測(cè)定的TSH量偏低。采血點(diǎn)應(yīng)稍微靠近足跟的左表面皮膚，最好抹掉第一滴血，用隨后形成的血滴。為提高嬰兒足跟針刺點(diǎn)血流，嬰兒足跟可用熱的（約42℃）濕毛巾敷3分鐘。不要過(guò)分?jǐn)D壓足部，否則會(huì)導(dǎo)致溶血或組織液的稀釋。一滴血形成后，用濾紙片輕輕地接觸血滴，但不要向足跟擠壓，從濾紙背面觀察血滴透過(guò)濾紙。

     一般一個(gè)嬰兒要收集三個(gè)血點(diǎn)（三滴血）的濾紙標(biāo)本，血樣點(diǎn)應(yīng)避免污染。置濾紙于水平位置，室溫空氣干燥2至6小時(shí)。注意不要加熱，不要堆積，不要接觸其他物品表面。將每個(gè)帶血標(biāo)本的濾紙片置于一個(gè)信封中，并郵寄到新生兒篩查中心實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本應(yīng)放置+4--+8℃防濕保存，并及時(shí)篩查。

     標(biāo)本收集卡應(yīng)注明以下內(nèi)容：醫(yī)院名稱，編號(hào)，嬰兒姓名，出生  年  月  日，住院號(hào)，家庭地址，電話和采血日期。

     標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)照雖然已經(jīng)滅活，但不能絕對(duì)認(rèn)為無(wú)傳染性，應(yīng)認(rèn)為有潛在的傳染可能。標(biāo)本等的處理按生物安全二級(jí)水平處理。詳見美國(guó)疾病控制中心國(guó)立健康研究所的“微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全”手冊(cè)。（1984）

 

第一步	用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控和標(biāo)本，并依次放置到包被板孔內(nèi)。
第二步	用酶標(biāo)記抗體稀釋液將酶標(biāo)記抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl。 室溫振動(dòng)（650rpm）孵育2小時(shí) 或室溫振動(dòng)（650rpm）15分鐘后，+4℃不振動(dòng)過(guò)夜。
第三步	去掉標(biāo)本的濾紙片，洗滌液洗滌4次，每次加入300ul。
第四步	加入200μl的底物溶液 室溫避光孵育15分鐘
第五步	加入100μl1N終止液 在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光度值。

 

檢測(cè)前，把所有的試劑和酶標(biāo)反應(yīng)板放置室溫+20--+25℃預(yù)熱30分鐘。

1.用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品（雙孔），質(zhì)控（雙孔）和標(biāo)本（每孔1片），并依次放置到抗-hTSH包被的酶標(biāo)板孔內(nèi)。

注意：圍繞血樣點(diǎn)中央對(duì)稱地打孔。

2.用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體按1：100倍稀釋，每孔加入200μl酶結(jié)合物溶液。

3.孵育

A：室溫（不超過(guò)+30℃）振動(dòng)（650rpm）孵育2小時(shí)。（貼上粘紙）

B：室溫振動(dòng)15分鐘后，+4℃不振動(dòng)過(guò)夜。（貼上粘紙）

注意：當(dāng)室溫>+30℃時(shí)，應(yīng)選擇過(guò)程B。

4.倒去溶液和吸去濾紙片。

5.洗滌

——手工洗滌

每孔加入300μl的洗滌液（試劑5）；

倒去，拍盡液體；

重復(fù)操作4次；

4次洗滌后，輕輕倒拍幾次酶標(biāo)板，倒放在紙巾上一會(huì)兒，吸盡殘液。

——機(jī)器洗滌

洗滌液每孔400μl，重復(fù)洗滌4次。

6.每孔加入200μl的底物溶液（試劑4a＋4b）。

7.室溫 (不超過(guò)+30℃)避光孵育30分鐘。（若室溫高于+30℃，則避光孵育15分鐘。）

8.每孔加入100μl1N終止液。

9.在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)為吸光度，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和標(biāo)本的濃度。

 

 

 

每批試劑盒的每套試劑盒內(nèi)都要一張單獨(dú)紙片，給出質(zhì)控的期望值，只有質(zhì)控測(cè)定值在期望值范圍內(nèi)，結(jié)果才能被接受。

對(duì)于正常的和假定的陽(yáng)性之間的區(qū)別，是根據(jù)一個(gè)預(yù)定的臨界值。臨界值是根據(jù)給定的正常人口hTSH值的參考范圍，憑經(jīng)驗(yàn)設(shè)定的，高于或接近臨界值的標(biāo)本建議復(fù)試。

敏感性 最小濃度為0.9mIU/L

精確性

批內(nèi)分析

批內(nèi)分析不精確度

 

批間分析

批間分析不精確度

 

其他腦垂體激素和人絨毛膜促性腺激素干擾實(shí)驗(yàn)

LH FSH HCG 干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定數(shù)量的每種激素。

 

在濃度為0.05-10g/l,無(wú)干擾現(xiàn)象。

準(zhǔn)確性

用CDC質(zhì)控標(biāo)本檢測(cè)

 

labsystems公司的臨床評(píng)估分別在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室。在上海新華醫(yī)院隨機(jī)抽查 10780名新生兒進(jìn)行篩查。樣品從剛剛出生三天的小孩采集。正常健康的嬰兒和甲低陽(yáng)性的嬰兒濃度分布模式圖如下：

 

10780份新生兒樣品檢測(cè)分布圖，預(yù)定的臨界值設(shè)置為10 mIU/L。此預(yù)定值重測(cè)率僅為0.41%。

 

 

低吸收值并且標(biāo)準(zhǔn)曲線很

高本底

低精密性

 

1.仔細(xì)閱讀試劑盒使用說(shuō)明書。

2.開始檢測(cè)前，把試劑盒內(nèi)所有的試劑及酶標(biāo)板放置+20--+25℃平衡30分鐘。

3.不要使用超過(guò)有效期的試劑，不要互用不同批號(hào)的試劑，因?yàn)槊颗��?hào)試劑的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控值有可能不同，注意標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控的單位，分清是血清還是全血。

4.建議每塊板都使用標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照。

5.檢測(cè)一旦開始，隨后的步驟應(yīng)連續(xù)地進(jìn)行下去，不要中斷。

6.嚴(yán)格操作，方能獲得理想的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)準(zhǔn)確地使用加液器，不要使加液頭子接觸孔壁，避免孔間污染；配制底物溶液等時(shí)，所用的器具必須是潔凈的，仔細(xì)地洗板是很重要的。

7.孵育時(shí)間的輕微變化是許可的,2小時(shí)±10分鐘，20分鐘±5分鐘。

8.TMB顯色劑必須在臨用前配制，TMB顯色劑是溶解在二甲基亞砜中的，二甲基亞砜對(duì)眼睛和皮膚有刺激，萬(wàn)一接觸眼睛應(yīng)立即用清水沖洗，然后去醫(yī)院治療；接觸皮膚后應(yīng)立即用大量清水沖洗；操作應(yīng)帶手套；氧化劑，金屬離子和肥皂殘留物均能干擾TMB的反應(yīng)。TMB的熔點(diǎn)是18℃，低于此溫度，易結(jié)晶，使用前應(yīng)放置+18--+25℃平衡溶解后用底物緩沖液稀釋配制。TMB顯色劑是光敏感性的，避免暴露在強(qiáng)光下。

9.清洗玻璃容器時(shí)，用1N的酸（HCL和H₂SO₄）徹底洗滌，然后用蒸餾水洗滌及遍。

10.     結(jié)果一定要以吸光度來(lái)判斷，不能憑目測(cè)判斷。

11.     本試劑盒應(yīng)貯存于+2--+8℃。