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                                                              English | 中文版 | 手機(jī)版 企業(yè)登錄 | 個(gè)人登錄 | 郵件訂閱
                                                              當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 新生兒促甲狀腺素(TSH)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書

                                                              新生兒促甲狀腺素(TSH)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書

                                                              瀏覽次數(shù):2971 發(fā)布日期:2011-10-28  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
                                                               
                                                              新生兒促甲狀腺素(TSH)檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書
                                                              德國(guó)IBL進(jìn)口原裝,酶標(biāo)儀定量檢測(cè)
                                                              德國(guó)IBL中國(guó)獨(dú)家代理商“深圳科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司”竭誠(chéng)為您服務(wù)
                                                               
                                                              中國(guó)SFDA注冊(cè):國(guó)食藥監(jiān)械(進(jìn))字2011第2400471號(hào)
                                                              產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)】SFDA(I)20112400471
                                                               
                                                              用途
                                                                  本試劑盒為體外測(cè)定試劑盒,用酶聯(lián)免疫法定量測(cè)定濾紙片上干燥血標(biāo)本中的促甲狀腺素(hTSH),作為新生兒先天性甲狀腺機(jī)能減退癥(簡(jiǎn)稱“甲低”)的篩查。
                                                              前言
                                                                   先天性“甲低”是以外周血甲狀腺激素(T3和T4)水平降低為特征的新生兒內(nèi)分泌障礙。世界范圍內(nèi)先天性“甲低”的平均發(fā)病率為1:4,000。此疾病特點(diǎn)是外周血中甲狀腺激素低于正常水平,而促甲狀腺素高于正常水平。人的促甲狀腺素是由腦垂體前葉合成分泌的。他調(diào)節(jié)和刺激甲狀腺產(chǎn)生甲狀腺激素。甲狀腺激素缺乏刺激hTSH分泌,存在負(fù)反饋。hTSH水平也受下丘腦分泌的促甲狀腺素釋放激素的影響。因此,新生兒外周血促甲狀腺素濃度提高,可作為篩查判斷先天性“甲低”的根據(jù)。
                                                                   新生兒出生前后時(shí)期和出生后幾個(gè)月內(nèi)甲狀腺激素的不足將妨礙其大腦的正常發(fā)育,其最終結(jié)果是導(dǎo)致不可修復(fù)的大腦功能障礙和骨骼神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙。早期篩查出新生兒先天性“甲低”,用甲狀腺激素的替代治療可防止大腦的發(fā)育不良。
                                                              原理
                                                              1.新生兒促甲狀腺激素酶聯(lián)免疫測(cè)定法(Neonatal hTSH EIA)是一種固相雙位點(diǎn)酶免疫測(cè)定法,濾紙片上干燥血標(biāo)本洗提出hTSH,同時(shí)與包被在酶標(biāo)板上抗hTSH的單克隆分子和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗hTSH亞單位的第二抗體結(jié)合。
                                                              2.過(guò)剩的酶結(jié)合物和未結(jié)合的hTSH被洗滌去掉,加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液進(jìn)行酶反應(yīng)。
                                                              3.加入1N硫酸(H2SO4)溶液終止酶反應(yīng),用酶標(biāo)讀數(shù)儀在450nm下測(cè)定吸光度值。
                                                              試劑盒組成
                                                              試劑盒貯存在+2—+8℃。
                                                              不要使用過(guò)期試劑。
                                                              試劑盒使用前,所有試劑及酶標(biāo)板放置+18—+25℃平衡30分鐘。
                                                              TMB底物是光敏感性的,應(yīng)避免光照。
                                                              所有試劑組份一旦開啟,密封袋或蓋子緊緊密封。
                                                              1    抗-hTSH包被的反應(yīng)板                           10塊(12×8孔)
                                                              2    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物(濃縮100X)   2.5ml
                                                              3    酶結(jié)合物稀釋液                                     250ml
                                                              4a   TMB顯色劑(25X)                                9.5ml
                                                              4b   底物緩沖液                                     250ml
                                                              5    洗滌液(濃縮10X)                             220ml
                                                              6    hTSH標(biāo)準(zhǔn)品                                    1張5套,每套6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品,用錫箔袋包裝。
                                                              每批標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)值是不相同的,每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。
                                                              7    hTSH質(zhì)控 C1-C2                       1張5套,含2個(gè)質(zhì)控,用錫箔袋包裝。
                                                              每批質(zhì)控的數(shù)值是不相同的,每套試劑盒內(nèi)都有確切的數(shù)值。
                                                              8 終止液 0.45M 硫酸
                                                                   酶標(biāo)反應(yīng)板的塑料粘膠貼                         10張
                                                                   質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品的TSH數(shù)值表                       1張
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                               
                                                              試劑的準(zhǔn)備
                                                              表1      試劑的準(zhǔn)備
                                                              試劑
                                                              準(zhǔn)備
                                                              開啟或稀釋后的穩(wěn)定性(+2—+8℃)
                                                              1    抗-hTSH包被的反應(yīng)板
                                                              直接使用
                                                              2個(gè)月
                                                              2    辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗-hTSH酶結(jié)合物(濃縮)
                                                              臨用前,用酶結(jié)合物稀釋液按1:100(1+99)稀釋配制。(見表2)
                                                              5個(gè)月
                                                              廢棄未用完的酶結(jié)合物溶液
                                                              3    酶結(jié)合物稀釋液
                                                              供配制酶結(jié)合物溶液用
                                                              10個(gè)月
                                                              4    底物溶液
                                                              臨用前,用底物緩沖液(4b)按1:25(1+24)將TMB顯色劑(4a)稀釋成底物溶液。
                                                              廢棄未用完的底物溶液
                                                              4a   TMB顯色劑
                                                              直接供配制底物溶液用
                                                              6個(gè)月
                                                              4b   底物緩沖液
                                                              直接供配制底物溶液用
                                                              6個(gè)月
                                                              5    洗滌液(濃縮)
                                                              用蒸餾水按1:10(1+9)稀釋
                                                              6個(gè)月
                                                              廢棄有渾濁的洗滌液
                                                              6    hTSH標(biāo)準(zhǔn)品
                                                              直接使用
                                                              3個(gè)月
                                                              7           hTSH質(zhì)控
                                                              8           終止液
                                                              直接使用
                                                              直接使用
                                                              3個(gè)月
                                                              6個(gè)月
                                                               
                                                              表2酶結(jié)合物和底物溶液的準(zhǔn)備配制
                                                              酶標(biāo)板數(shù)(塊)
                                                              酶結(jié)合物(2)
                                                              (ml)
                                                              酶結(jié)合物稀釋液(3)(ml)
                                                              TMB-顯色劑(4a)(ml)
                                                              底物緩沖液(4b)(ml)
                                                              1
                                                              0.24
                                                              24
                                                              1
                                                              24
                                                              2
                                                              0.42
                                                              42
                                                              2
                                                              48
                                                              3
                                                              0.62
                                                              62
                                                              3
                                                              72
                                                              4
                                                              0.82
                                                              82
                                                              4
                                                              96
                                                              5
                                                              1.00
                                                              100
                                                              5
                                                              120
                                                              6
                                                              1.20
                                                              120
                                                              6
                                                              144
                                                              7
                                                              1.38
                                                              138
                                                              7
                                                              168
                                                              8
                                                              1.58
                                                              158
                                                              8
                                                              192
                                                              9
                                                              1.76
                                                              176
                                                              9
                                                              216
                                                              10
                                                              2.00
                                                              200
                                                              10
                                                              240
                                                               
                                                              試劑盒中未提供的所需器材
                                                              蒸餾水;量筒;試劑瓶;加樣槍;吸水紙;計(jì)時(shí)器;橡膠手套
                                                              —酶標(biāo)讀數(shù)儀  如芬蘭Labsystems Multiskan
                                                              —板的振蕩器  如芬蘭Labsystems iEMS Incubator/Shaker
                                                              —洗板機(jī)      如芬蘭Labsystems Multiwash
                                                              —8-道加液器(50—300μl)
                                                              —(3mm)打孔器
                                                               
                                                              標(biāo)本的收集和處理
                                                                   嬰兒出生后3—5天,用濾紙從嬰兒的足跟取一滴血液,獲得帶血點(diǎn)(直徑0.8cm)的濾紙片,并確信濾紙片被血樣完全浸透,帶血樣的濾紙片至少晾干2小時(shí),帶血樣的干燥濾紙片(密封)在+4--+8℃至少可貯存4個(gè)月時(shí)間。
                                                                   濾紙片標(biāo)本的收集一定是單一的一滴血液,否則會(huì)造成假陽(yáng)性結(jié)果。這一滴血在濾紙片上擴(kuò)展的面積要足夠大,保證血液從濾紙的上面均勻浸透到下面,浸透不完全會(huì)造成測(cè)定的TSH量偏低。采血點(diǎn)應(yīng)稍微靠近足跟的左表面皮膚,最好抹掉第一滴血,用隨后形成的血滴。為提高嬰兒足跟針刺點(diǎn)血流,嬰兒足跟可用熱的(約42℃)濕毛巾敷3分鐘。不要過(guò)分?jǐn)D壓足部,否則會(huì)導(dǎo)致溶血或組織液的稀釋。一滴血形成后,用濾紙片輕輕地接觸血滴,但不要向足跟擠壓,從濾紙背面觀察血滴透過(guò)濾紙。
                                                                   一般一個(gè)嬰兒要收集三個(gè)血點(diǎn)(三滴血)的濾紙標(biāo)本,血樣點(diǎn)應(yīng)避免污染。置濾紙于水平位置,室溫空氣干燥2至6小時(shí)。注意不要加熱,不要堆積,不要接觸其他物品表面。將每個(gè)帶血標(biāo)本的濾紙片置于一個(gè)信封中,并郵寄到新生兒篩查中心實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室收到標(biāo)本應(yīng)放置+4--+8℃防濕保存,并及時(shí)篩查。
                                                                   標(biāo)本收集卡應(yīng)注明以下內(nèi)容:醫(yī)院名稱,編號(hào),嬰兒姓名,出生      日,住院號(hào),家庭地址,電話和采血日期。
                                                              警告有潛在生物危險(xiǎn)的材料
                                                                   標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)照雖然已經(jīng)滅活,但不能絕對(duì)認(rèn)為無(wú)傳染性,應(yīng)認(rèn)為有潛在的傳染可能。標(biāo)本等的處理按生物安全二級(jí)水平處理。詳見美國(guó)疾病控制中心國(guó)立健康研究所的“微生物和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全”手冊(cè)。(1984)
                                                               
                                                              操作步驟
                                                              操作步驟簡(jiǎn)圖
                                                              第一步
                                                              用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品,質(zhì)控和標(biāo)本,并依次放置到包被板孔內(nèi)。
                                                              第二步
                                                              用酶標(biāo)記抗體稀釋液將酶標(biāo)記抗體按1:100倍稀釋,每孔加入200μl。
                                                              室溫振動(dòng)(650rpm)孵育2小時(shí)
                                                              或室溫振動(dòng)(650rpm)15分鐘后,+4℃不振動(dòng)過(guò)夜。
                                                              第三步
                                                              去掉標(biāo)本的濾紙片,洗滌液洗滌4次,每次加入300ul。
                                                              第四步
                                                              加入200μl的底物溶液
                                                              室溫避光孵育15分鐘
                                                              第五步
                                                              加入100μl1N終止液
                                                              在波長(zhǎng)450nm下測(cè)定吸光度值。
                                                               
                                                              檢測(cè)前,把所有的試劑和酶標(biāo)反應(yīng)板放置室溫+20--+25℃預(yù)熱30分鐘。
                                                              1.用打孔器在濾紙上打下3mm直徑的標(biāo)準(zhǔn)品(雙孔),質(zhì)控(雙孔)和標(biāo)本(每孔1片),并依次放置到抗-hTSH包被的酶標(biāo)板孔內(nèi)。
                                                              注意:圍繞血樣點(diǎn)中央對(duì)稱地打孔。
                                                              2.用酶標(biāo)抗體稀釋液將酶標(biāo)抗體按1:100倍稀釋,每孔加入200μl酶結(jié)合物溶液。
                                                              3.孵育
                                                              A:室溫(不超過(guò)+30℃)振動(dòng)(650rpm)孵育2小時(shí)。(貼上粘紙)
                                                              B:室溫振動(dòng)15分鐘后,+4℃不振動(dòng)過(guò)夜。(貼上粘紙)
                                                              注意:當(dāng)室溫>+30℃時(shí),應(yīng)選擇過(guò)程B。
                                                              4.倒去溶液和吸去濾紙片。
                                                              5.洗滌
                                                              ——手工洗滌
                                                              每孔加入300μl的洗滌液(試劑5);
                                                              倒去,拍盡液體;
                                                              重復(fù)操作4次;
                                                              4次洗滌后,輕輕倒拍幾次酶標(biāo)板,倒放在紙巾上一會(huì)兒,吸盡殘液。
                                                              ——機(jī)器洗滌
                                                              洗滌液每孔400μl,重復(fù)洗滌4次。
                                                              6.每孔加入200μl的底物溶液(試劑4a+4b)。
                                                              7.室溫 (不超過(guò)+30℃)避光孵育30分鐘。(若室溫高于+30℃,則避光孵育15分鐘。)
                                                              8.每孔加入100μl1N終止液。
                                                              9.在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的吸光度值。
                                                              結(jié)果
                                                              結(jié)果的計(jì)算:
                                                              繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,縱坐標(biāo)為吸光度,橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取質(zhì)控和標(biāo)本的濃度。
                                                               
                                                               
                                                               
                                                              質(zhì)量控制值
                                                              每批試劑盒的每套試劑盒內(nèi)都要一張單獨(dú)紙片,給出質(zhì)控的期望值,只有質(zhì)控測(cè)定值在期望值范圍內(nèi),結(jié)果才能被接受。
                                                              期望值和結(jié)果說(shuō)明
                                                              對(duì)于正常的和假定的陽(yáng)性之間的區(qū)別,是根據(jù)一個(gè)預(yù)定的臨界值。臨界值是根據(jù)給定的正常人口hTSH值的參考范圍,憑經(jīng)驗(yàn)設(shè)定的,高于或接近臨界值的標(biāo)本建議復(fù)試。
                                                              性能特點(diǎn)
                                                              敏感性 最小濃度為0.9mIU/L
                                                              精確性
                                                              批內(nèi)分析
                                                              批內(nèi)分析不精確度
                                                               
                                                              批間分析
                                                              批間分析不精確度
                                                               
                                                              其他腦垂體激素和人絨毛膜促性腺激素干擾實(shí)驗(yàn)
                                                              LH FSH HCG 干擾實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 在含10 mIU/LTSH血清中加入一定數(shù)量的每種激素。
                                                               
                                                              膽紅素干擾實(shí)驗(yàn)
                                                              在濃度為0.05-10g/l,無(wú)干擾現(xiàn)象。
                                                              準(zhǔn)確性
                                                              用CDC質(zhì)控標(biāo)本檢測(cè)
                                                               
                                                              臨床評(píng)估
                                                              labsystems公司的臨床評(píng)估分別在兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)室。在上海新華醫(yī)院隨機(jī)抽查 10780名新生兒進(jìn)行篩查。樣品從剛剛出生三天的小孩采集。正常健康的嬰兒和甲低陽(yáng)性的嬰兒濃度分布模式圖如下:
                                                               
                                                              10780份新生兒樣品檢測(cè)分布圖,預(yù)定的臨界值設(shè)置為10 mIU/L。此預(yù)定值重測(cè)率僅為0.41%。
                                                               
                                                              常見錯(cuò)誤及糾正
                                                               
                                                              低吸收值并且標(biāo)準(zhǔn)曲線很
                                                              原因
                                                              糾正
                                                              1試劑變質(zhì)
                                                               *由于污染
                                                               *由于儲(chǔ)存不當(dāng)
                                                              1當(dāng)需要從一個(gè)試劑瓶中反復(fù)移液使用無(wú)菌操作技術(shù)
                                                              2根據(jù)說(shuō)明書所述儲(chǔ)存試劑
                                                              2試劑沒(méi)有預(yù)熱到室溫
                                                              用溫度計(jì)檢查溫度
                                                              3反應(yīng)時(shí)間過(guò)短
                                                              根據(jù)說(shuō)明書所述進(jìn)行保溫
                                                              4讀數(shù)儀波長(zhǎng)設(shè)置不正確
                                                              讀數(shù)波長(zhǎng)應(yīng)為450nm
                                                              5讀數(shù)儀被設(shè)置成減去空白
                                                              重新設(shè)置讀數(shù)儀
                                                              高本底
                                                              原因
                                                              糾正
                                                              1由于吸液不充分引起的洗板不充分
                                                              1調(diào)節(jié)清洗頭
                                                              2檢查清洗頭是否被纖維堵塞
                                                              2保溫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
                                                              根據(jù)說(shuō)明書所述進(jìn)行保溫
                                                              3保溫溫度過(guò)高
                                                              使用室溫振蕩15分鐘,4℃過(guò)夜的方式,底物保溫使用15分鐘.
                                                              低精密性
                                                              原因
                                                              糾正
                                                              只有標(biāo)準(zhǔn)曲線不好
                                                              標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控由于不恰當(dāng)?shù)膬?chǔ)存而變質(zhì)
                                                              避免過(guò)度陽(yáng)光和潮濕,將標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控同干燥劑密封在錫箔袋中,干燥劑應(yīng)是藍(lán)色的.
                                                              整板不好
                                                              1移液設(shè)備未正確校正
                                                              檢查與校正移液器
                                                              2由于洗頭的污染而導(dǎo)致不正確的洗板
                                                              經(jīng)常清潔清洗頭
                                                              3洗板后停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng),板已干燥
                                                              根據(jù)說(shuō)明書操作
                                                              只有病人樣品不好
                                                              樣品中血液的不平均分配
                                                              如果可能,應(yīng)使用被血液完全浸透的樣品
                                                               
                                                              操作注意事項(xiàng)
                                                              1.仔細(xì)閱讀試劑盒使用說(shuō)明書。
                                                              2.開始檢測(cè)前,把試劑盒內(nèi)所有的試劑及酶標(biāo)板放置+20--+25℃平衡30分鐘。
                                                              3.不要使用超過(guò)有效期的試劑,不要互用不同批號(hào)的試劑,因?yàn)槊颗?hào)試劑的標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控值有可能不同,注意標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控的單位,分清是血清還是全血。
                                                              4.建議每塊板都使用標(biāo)準(zhǔn)品和對(duì)照。
                                                              5.檢測(cè)一旦開始,隨后的步驟應(yīng)連續(xù)地進(jìn)行下去,不要中斷。
                                                              6.嚴(yán)格操作,方能獲得理想的檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)準(zhǔn)確地使用加液器,不要使加液頭子接觸孔壁,避免孔間污染;配制底物溶液等時(shí),所用的器具必須是潔凈的,仔細(xì)地洗板是很重要的。
                                                              7.孵育時(shí)間的輕微變化是許可的,2小時(shí)±10分鐘,20分鐘±5分鐘。
                                                              8.TMB顯色劑必須在臨用前配制,TMB顯色劑是溶解在二甲基亞砜中的,二甲基亞砜對(duì)眼睛和皮膚有刺激,萬(wàn)一接觸眼睛應(yīng)立即用清水沖洗,然后去醫(yī)院治療;接觸皮膚后應(yīng)立即用大量清水沖洗;操作應(yīng)帶手套;氧化劑,金屬離子和肥皂殘留物均能干擾TMB的反應(yīng)。TMB的熔點(diǎn)是18℃,低于此溫度,易結(jié)晶,使用前應(yīng)放置+18--+25℃平衡溶解后用底物緩沖液稀釋配制。TMB顯色劑是光敏感性的,避免暴露在強(qiáng)光下。
                                                              9.清洗玻璃容器時(shí),用1N的酸(HCL和H2SO4)徹底洗滌,然后用蒸餾水洗滌及遍。
                                                              10.     結(jié)果一定要以吸光度來(lái)判斷,不能憑目測(cè)判斷。
                                                              11.     本試劑盒應(yīng)貯存于+2--+8℃。
                                                               
                                                               
                                                              中國(guó)獨(dú)家總代理:深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司
                                                              公司地址:深圳市南山區(qū)蛇口沿山路10號(hào)6層。郵編:518067
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