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去甲變腎上腺素ELISA試劑盒使用說明

瀏覽次數(shù)：2032　發(fā)布日期：2011-9-8　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

去甲變腎上腺素ELISA試劑盒使用說明

(德國IBL：RE59171)

前言說明

兒茶酚胺類腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺都是在腎上腺髓質(zhì)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和腦中合成的。它們幾乎影響所有的組織，并與其它激素和神經(jīng)系統(tǒng)一起參與各種生理過程的調(diào)節(jié)。因?yàn)閮翰璺影奉愇镔|(zhì)以及它們的代謝產(chǎn)物變腎上腺素和去甲變腎上腺素在許多疾病中的分泌都會(huì)增加，因此對它們進(jìn)行檢測可用于這些疾病的診斷。在這一實(shí)驗(yàn)中，診斷和神經(jīng)系統(tǒng)的續(xù)發(fā)性腫瘤都具有特殊的重要性。這一技術(shù)主要用于嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤的診斷檢測。10%的嗜鉻細(xì)胞瘤表現(xiàn)為惡性增長。而在良性腫瘤中可發(fā)現(xiàn)兒茶酚胺類物質(zhì)及它們的代謝產(chǎn)物變腎上腺素和去甲變腎上腺素都會(huì)增加。

1、應(yīng)用范圍

此酶免試劑盒可用于人體尿液中去甲變腎上腺素的體外定量檢測,可手動(dòng)操作也可自動(dòng)操作.

2、實(shí)驗(yàn)原理

此ELISA試劑盒利用的是競爭法原理，生物素標(biāo)記抗原和未用生物素標(biāo)記抗原競爭結(jié)合一定量的抗體結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合到抗體上生物素標(biāo)記抗原的量與樣品中被分析物的濃度成反比。反應(yīng)系統(tǒng)達(dá)到平衡后，未結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗原用洗滌液洗去。以抗生物素堿性磷酸酶作為標(biāo)記物，以PNPP(對硝基苯酚磷酸鹽)作為底物液來檢測結(jié)合到抗體上的生物素抗原的量。將未知物的酶反應(yīng)活性和已知標(biāo)準(zhǔn)品的反應(yīng)曲線相比較，可以得到未知物的量。

3、 意事項(xiàng)和預(yù)防措施

1) 此試劑盒僅用于體外診斷和專業(yè)人士使用。

2) 在檢測開始之前，仔細(xì)和完整的閱讀說明書，使用試劑盒提供的包裝插件的有效版本，確保所有的程序都清楚。尋求更多信息（比如：臨床背景，檢測操作，自動(dòng)化操作說明，可選擇的軟件，文獻(xiàn)等等），請查看IBL公司主頁。

3) 如果試劑盒有破壞的請與IBL公司聯(lián)系或是提交你的申請，但自您拿到試劑盒后最遲不超過一個(gè)星期。檢測時(shí)請不要使用已被損害的試劑，以確保自身安全。

4) 按照批號和有效期，不混合使用不同批號的試劑，也不要使用過期的試劑。

5) 遵守好的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則和安全指南。穿實(shí)驗(yàn)服，帶橡皮手套，有必要時(shí)請戴護(hù)目鏡。

6) 此試劑盒中含有會(huì)傷害眼睛和皮膚的有害試劑。請閱讀材料來源和標(biāo)簽獲取詳細(xì)信息。產(chǎn)品的材料安全數(shù)據(jù)單能夠從IBL公司主頁上下載，也可直接咨詢IBL公司獲取。

7) 根據(jù)國家生物有害物質(zhì)及安全條例，所有化學(xué)藥品和準(zhǔn)備或使用過的試劑都應(yīng)當(dāng)做有害物質(zhì)進(jìn)行處理。

8) 不要接觸終止液，以免造成皮膚損傷或著燒。

4、 存與穩(wěn)定性

試劑盒和運(yùn)輸環(huán)境和儲(chǔ)存環(huán)境溫度為2-8℃，避免熱源或太陽直射。樣品的儲(chǔ)存與穩(wěn)定性及試劑的準(zhǔn)備將在相關(guān)章節(jié)中闡述。開封的試劑盒在有效期內(nèi)穩(wěn)定，前提是要將試劑盒用袋子密封并儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下。

5、 樣品的采集與貯存

注意	人體內(nèi)的兒茶酚氨和間甲腎上腺素的釋放會(huì)受到一些食品和藥物的影響。因此在樣品采集前72小時(shí)內(nèi)病人應(yīng)禁止服用下列食物和藥品：維生素B，咖啡，香蕉，α甲基多巴，MAO，COMT抑制劑，還有降血壓類藥物。

尿液

可以是自然尿液也可使用24h尿液。將病人24h內(nèi)的所有尿液都收集到，并混合于含10-15ml 6N的HCl防腐劑的試劑瓶中。
貯存	≤-20℃	避免熱源或太陽直射，避免反復(fù)凍融，冷凍狀態(tài)下運(yùn)輸樣品。
穩(wěn)定性	6個(gè)月

6、 試劑盒成分

注意	試劑盒有足夠做96份單孔檢測或48份雙孔檢測或間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素共同檢測時(shí)所需的試劑成分

數(shù)量	標(biāo)記	成分
1×50mL	ASSAYBUF CONC	檢測緩沖液，10倍濃縮，內(nèi)含磷酸緩沖液，BSA（牛血清白蛋白），1%的NaN3
1×2.25mL	ACYLREAG	�；噭�，即用，內(nèi)含二甲基甲酰胺
1×10mL	INDICATIORBUF	指示劑緩沖液，紫色，即用，內(nèi)含Tris緩沖液和苯酚紅（pH小于7.5時(shí)顏色會(huì)發(fā)生變化）。
2×50×	HYDRTUB	水解試管，可處理的聚苯乙烯試管
1×20mL	HCl	HCl，即用，內(nèi)含0.1M HCl
1×12×8	MTP	包被板，可拆分，包被有抗兔IgG（羊，多克隆）
1×7×0.35mL	CAL A-G	標(biāo)準(zhǔn)品，A-G含去甲變腎上腺素和0.1M的HCl 0; 77; 192; 480; 1200; 3000; 7500μmol/L 0; 0.42; 1.05; 2.63; 6.56; 16.4; 41.0μmol/L
1×2×0.5mL	CONTROL 1+2	質(zhì)控1+2，即用，濃度及允許范圍請見標(biāo)簽
3×	BIOTIN LYO	去甲變腎上腺素生物素(凍干品)，內(nèi)含去變甲狀腺生物素, Tris緩沖液,<0.1%NaN3(可再生)
1×7m L	ANTISERUM	去甲變腎上腺素抗血清，內(nèi)含含抗血清(兔),磷酸緩沖液,0.1%NaN3
1×250μl	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物(100×)，含抗生物素抗體,并聯(lián)結(jié)到堿性磷酸酶上,Tris緩沖液,0.01%NaN3
9×	PNPP SUBS	PNPP底物片，含PNPP
1×27mL	PNPP BUF	PNPP底物緩沖液，含二乙醇胺、水和0.05%NaN3
1×15mL	PNPP STOP	PNPP終止液，即用，內(nèi)含1M的NaOH和0.25M的EDTA。
1×50mL	WASHBUF CONC	洗滌液(10×)，含Tris緩沖液,HCL,吐溫,0.2%NaN3
3×	FOIL	粘性金屬板

7、實(shí)驗(yàn)所需器材（但試劑盒不提供）

1) 移液器，體積：10;50;100;1000ul

2) 玻璃試管（12×75mm）

3) 振蕩器（200-900rpm）

4) 旋渦混合器

5) 水浴箱，90℃

6) 帶試劑儲(chǔ)器的8孔移液器

7) 洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)包被板洗滌系統(tǒng)。

8) 可在405nm處讀數(shù)的酶標(biāo)儀（參考波長：600-650nm）

9) 雙蒸水或去離子水

10) 吸水紙，取樣吸頭和計(jì)時(shí)器

8、注意事項(xiàng)

1) 樣品的不合理處理及實(shí)驗(yàn)操作的任何改動(dòng)都將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取樣體積、溫育時(shí)間、欲處理步驟都必須嚴(yán)格按說明進(jìn)行。只能使用標(biāo)準(zhǔn)移液器和標(biāo)準(zhǔn)設(shè)備。

2) 一旦實(shí)驗(yàn)開始，所有的步驟都必須完整的進(jìn)行下去，切勿中斷。確保所有試劑、材料和設(shè)備都已準(zhǔn)備好。把所有試劑和樣品都平衡至18-25℃，在使用前，輕輕搖動(dòng)液體試劑和樣品，試劑混合過程時(shí)要避免產(chǎn)生氣泡。

3) 請勿接觸試劑、移液器、微孔/試管。加試劑和樣本時(shí)，請使用新的吸頭，以避免交叉污染。不用的試劑應(yīng)用蓋子蓋好，以免重復(fù)使用。

4) 我們建議對樣品進(jìn)行雙份檢測，以便能糾正潛在的滴定錯(cuò)誤

5) 用定標(biāo)儀對反應(yīng)板進(jìn)行校準(zhǔn)。

6) 溫育時(shí)間會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。微孔加樣的順序和時(shí)間都必須一致。建議使用8孔移液器加樣。

7) 包被板的清洗很重要，清洗不合理將會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。建議使用多孔移液器或自動(dòng)包被板清洗系統(tǒng)進(jìn)行清洗。溫育期間避免微孔干燥，清洗和吸液時(shí)不要碰到包被板微孔。清洗時(shí)，確保所有的微孔都充滿蒸餾水，并且無殘留物。

8) 濕度會(huì)對包被孔產(chǎn)生影響，所以包被板未平衡到室溫時(shí)不要打開包裝。不使用的微孔應(yīng)立即裝入含干燥劑的包裝袋中。

9、實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備說明

手動(dòng)或自動(dòng)操作參考說明

注意	這種96人份的試劑盒可分成3份獨(dú)立進(jìn)行，以下體積為4條（32人份）一次檢測所需體積。如果想把標(biāo)準(zhǔn)品從7份減到6份，可以把標(biāo)準(zhǔn)品G棄取。而允許范圍相應(yīng)的減少到3000μg/l。

如果檢測是用了很多板條，則體積應(yīng)相應(yīng)改變。

9.1凍干成分或濃縮成分的準(zhǔn)備

特別注意	如果你使用甲狀腺ELISA試劑盒來同時(shí)檢測間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素，請勿混合間甲腎上腺素和去甲變腎上腺素酶聯(lián)物。
稀釋/溶解	成分		稀釋	比例	備注	貯存	穩(wěn)定性
15mL	檢測用緩沖液	150mL	雙蒸水	1:10		2-8°C	2周
15mL	洗滌液	150mL	雙蒸水	1:10		2-8°C	4周
1瓶	去甲變腎上腺素生物素	2mL	稀釋的檢測緩沖液		臨時(shí)配制,僅使用一次,靜置5min,混合時(shí)避免氣泡.	≤-20°C	2個(gè)月
60μl	酶聯(lián)物	6mL	稀釋的檢測緩沖液	1:101	臨時(shí)配制,僅使用一次	18-25°C	5小時(shí)
3	PNPP底物片	8mL	PNPP底物緩沖液		臨時(shí)配制,僅使用一次	18-25°C	5小時(shí)

9.2總?cè)ゼ鬃兡I上腺素檢測用的尿液樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的水解（在水解試管中）

注意	水解這一步驟在總?cè)ゼ鬃兡I上腺素和總間甲腎上腺素的檢測中是必備的。而在游離去甲變腎上腺素和變腎上腺素的檢測中則無須水解。樣品被懷疑高于最高標(biāo)準(zhǔn)的樣品必須在水解步驟前用0.1M HCL進(jìn)行稀釋。

9.2.1水解試管中樣品的準(zhǔn)備

1) 將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和尿液樣品各10μL加入到相應(yīng)的水解試管中

2) 在每一試管中加入40μL0.1M的HCl。

3) 蓋好試管，90°C下水解1h（用溫度計(jì)測溫度）。之后平衡至室溫，旋渦混合。

4) 在每一試管中加入100μL指示劑緩沖液，旋渦混合。

5) 在每一試管中加入20μL的�；饔迷噭尤胫甘緞┖罅⒓凑鹗�，確保加入的�；噭┖驮嚬軆�(nèi)物質(zhì)完全混合。

6) 蓋好試管，室溫下溫育15min。

7) 在每一試管中加入1mL稀釋的檢測緩沖液。

10、實(shí)驗(yàn)步驟

手動(dòng)和自動(dòng)操作

1) 將�；瘶�(biāo)準(zhǔn)品、酰化質(zhì)控品和�；∪藰悠贩謩e50μL加入到相應(yīng)的微孔中。

2) 在每一微孔中加入50μL去甲變腎上腺素生物素。

3) 在每一微孔中加入50μL去甲變腎上腺素抗血清。

4) 蓋板，小心振蕩包被板。振蕩器（500rpm）上室溫溫育1h（500rpm）

5) 移去粘性金屬板。棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250μL洗滌液洗板6次（洗板機(jī)洗）,(人工清洗則洗3次即可)，吸水紙上拍干。

6) 在每一微孔中加入150μL臨時(shí)配制的酶聯(lián)物。

7) 蓋上一新的粘性金屬板。振蕩器（500rpm）上室溫（18-25℃）溫育30min。

8) 移去粘性金屬板。棄取孔內(nèi)反應(yīng)液，每孔用250μL洗滌液洗板6次（洗板機(jī)洗）,(人工清洗則洗3次即可)，吸水紙上拍干。

9) 如果有條件的話，使用8孔微量移液器加底物液和終止液時(shí)。確保底物液和終止液都是相同的時(shí)間間隔加入。使用自動(dòng)置換型移液器并避免氣泡產(chǎn)生。

10) 在每一微孔中加入100μL臨時(shí)配制的PNPP底物液。

11) 振蕩器（500rpm）上室溫（18-25℃）溫育20min。

12) 在每一微孔中加入100μL PNPP終止液以終止底物反應(yīng)，輕輕振板以混合溶液。

13) 加入終止液后60min之內(nèi)在405nm處測OD值（參考波長：60 0-650nm）

11、結(jié)果計(jì)算

在半對數(shù)坐標(biāo)紙上或用自動(dòng)的方法，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為Y軸，濃度為X軸，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。用立體圖、4參數(shù)對數(shù)圖或?qū)?shù)-對數(shù)圖都可獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，用標(biāo)準(zhǔn)品的每一單值進(jìn)行計(jì)算（樣品結(jié)果明顯異常的值必須刪除掉，應(yīng)使用更加合理的單值）。樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得。一旦樣品稀釋了，就應(yīng)當(dāng)乘以相應(yīng)的稀釋因子。如果樣品所測得的濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備說明所述對樣品進(jìn)行稀釋，并重新檢測。

計(jì)算每一尿液樣品的24小時(shí)的排泄量：μg/24h=μg/L×L/24h

轉(zhuǎn)換：1ng/mL=1μmol/L

去甲變腎上腺素(μg/L)×5.46×10^-3=μmol/L

12、期望值

實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能當(dāng)作判斷任何治療結(jié)果的唯一因素，疾病的判斷還應(yīng)當(dāng)與其它臨床觀察和診斷檢測相結(jié)合。以下結(jié)果為正常人群的正常值（5%-95%）：

平均值：230ug/d 范圍：35-445ug/d（95%）

建議每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都確定自己實(shí)驗(yàn)室的正常值范圍。

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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