卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒使用說明

（德國DRG：EIA-1288）

1、應(yīng)用范圍

DRG公司的卵泡刺激素酶免試劑盒可用于血清中FSH（卵泡刺激素）的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。

2、前言說明

FSH和LH兩者密切的控制著性腺組織的生長和的繁殖活動，性腺組織通過負(fù)反饋的構(gòu)效關(guān)系合成和分泌雄性激素和雌性激素。FSH是垂體前葉嗜堿細(xì)胞分泌的一種糖蛋白。下丘腦產(chǎn)生的促性腺激素釋放激素（GnRH）可控制垂體前葉FSH的釋放。和其它糖蛋白一樣，如：LH、TSH和HCG，FSH由兩個亞單位組成，分別為α和β。這種類型的激素其α亞單位在結(jié)構(gòu)上都非常類似，因此每一激素的生物學(xué)和免疫學(xué)活性主要依賴于其β亞單位的獨特性。在女性中，FSH直接作用于粒細(xì)胞的受體而刺激卵泡的生長和成熟；從而增加卵泡類固醇激素的分泌和LH的產(chǎn)生。產(chǎn)生的LH之后結(jié)合到卵泡膜細(xì)胞上并刺激類固醇的分泌。在接近卵泡成熟時，卵巢內(nèi)雌二醇的水平就開始增加，于是雌二醇的刺激作用可增加FSH受體的活性和FSH卵泡性結(jié)合。因此，在女性中，FSH、LH和雌二醇密切相連促進(jìn)卵巢的發(fā)育和成熟。在絕經(jīng)后、閹割和卵巢早衰的情況下，FSH的水平會表現(xiàn)為提高。通過雌激素的調(diào)節(jié)（雌激素表現(xiàn)的是一種負(fù)反饋機制），FSH的水平可能會變得規(guī)范化。FSH和LH、FSH和雌激素之間關(guān)系的不正常與神經(jīng)性食欲缺乏癥和多囊卵巢并相關(guān)聯(lián)。當(dāng)FSH隨機抽樣的濃度超過10mIU/mL時表明患有卵巢衰竭疾病的這一觀點，人們對此存在著明顯的異議。男性中，生精小管的發(fā)育和精子發(fā)生的維持同樣會受到FSH的調(diào)節(jié)。然而和雌激素不一樣，雄性激素并不會降低FSH的水平，因此它僅與血清LH之間表現(xiàn)為負(fù)反饋的關(guān)系。因為對FSH還不是完全了解，但人們發(fā)現(xiàn)精子稀少的男性通常FSH水平會提高。如通過放免檢測得到的結(jié)果：睪丸癌一般會降低血清FSH濃度，而提高LH濃度。因此人們推測：LH濃度的明顯增加可能是通過與由睪丸癌分泌的hCG樣物質(zhì)的交叉反應(yīng)所造成的。在原發(fā)性睪丸功能障礙和克氏綜合征男性患者中，我們可發(fā)現(xiàn)高濃度的FSH水平。 FSH濃度的提高同樣也出現(xiàn)在饑餓、腎功能衰竭、甲狀腺功能亢進(jìn)和肝硬化的情況下。

3、實驗原理

   DRG公司的FSH酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合FSH分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性FSH的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗FSH抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。結(jié)合上的辣根過氧化物酶的總量與樣本中FSH的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中FSH的濃度成正比。

4、試劑盒成分

1)      微量反應(yīng)板，1塊 ( 96孔) ，微孔中包被了抗FSH的單克隆抗體。

2)      酶聯(lián)物，1ml，內(nèi)含抗辣根過氧酶標(biāo)記的抗FSH抗血清。

3)      底物液，11ml (TMB)

4)      標(biāo)準(zhǔn)系列，6支（凍干粉），即: 0,5,10,20,50,100mIU/ml，轉(zhuǎn)換系數(shù)：1ng/ml=0.34mIU/ml。

5)      終止液:   0.5M的H2SO4,，6ml

5、實驗需要器材（但試劑盒不提供）

1)      酶標(biāo)儀(450±10nm)。

2)      移液器

3)      吸水紙

4)      標(biāo)準(zhǔn)水箱

5)      蒸餾水

6、試劑貯存:

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑，酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。如果包被板的包裝被打開，其免疫活性在6周內(nèi)穩(wěn)定，但前提是必須將它密封在裝有干燥劑的袋子里。

7、樣品的采集

1)      靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下用離心機分離血清，避免溶血。

2)      必須蓋住樣本并在實驗之前于２-８℃下可貯存48小時。樣品需要更長的貯存時間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣本在檢測之前必須上下倒置幾次。

注意：用于此試劑盒的樣品不能含有任何添加劑。

8、試劑的準(zhǔn)備

參考標(biāo)準(zhǔn)：在凍干的標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.0ml雙蒸水。

注意：配制好了的標(biāo)準(zhǔn)品可在2-8℃下穩(wěn)定存放2個月。想要存放更長時間應(yīng)當(dāng)將其凍存于-20℃的環(huán)境下。

9、一般注意事項

1)      實驗開始前，將所有試劑和樣本都平衡至室溫,試劑混合時避免起泡。

2)      實驗一旦開始,所有的步驟應(yīng)完整地進(jìn)行下去。

3)      每一樣品的取樣都得使用新的取樣吸頭。

4)      吸光度與溫育時間和溫度有關(guān)，在實驗開始后所有的試劑都應(yīng)準(zhǔn)備好，以保證加液時間的一致。

5)      本試劑盒最大吸光度(OD)在1.200-2.000之間(室溫22℃,顯色10分鐘以內(nèi))。如果最大OD值高于您酶標(biāo)儀的上限或低于1.000，則相應(yīng)的減少或延長顯色反應(yīng)的溫育時間。一般情況下，酶免反應(yīng)的強度與時間和溫度成線性，這使得操作者應(yīng)當(dāng)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整物理化學(xué)環(huán)境。

10、實驗步驟

1)      將所需數(shù)目的板條置于板架上。

2)      將黃體生成素標(biāo)準(zhǔn)系列(0；5；20；50；100；200ng/ml)、質(zhì)控和血清樣本分別25μl加入到相應(yīng)的微孔中，每一樣品都得使用新的取樣吸頭。

3)      加100μl的抗FSH酶聯(lián)物于各孔中。

4)      混勻10秒,此步驟中完全混勻很重要。

5)      室溫溫育(22℃)30分鐘。

6)      棄去孔內(nèi)的反應(yīng)液。

7)      用蒸餾水洗板5次。

8)      在吸水紙上把板拍干。

9)      依原先加樣順序,每孔加100μl底物液。

10)  室溫(22℃)溫育10分鐘。

11)  按加底物液順序,每孔加50μl終止液于各孔中。

12)  10分鐘內(nèi)在450nm波長讀吸光度。

11、結(jié)果計算

1)      計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)      用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值（mIU/ml）進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)      用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。根據(jù)自己的實際經(jīng)驗或計算機的功能，也可以采用其它的歸納方法進(jìn)行計算。

4)      任何稀釋了的樣品在計算時都必須將相應(yīng)的稀釋因子考慮進(jìn)去。

12、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。以下結(jié)果是以一定量正常人群的血液樣本為準(zhǔn)得出的實驗結(jié)果：

    男性                    2.0—10

    女性  卵泡期            2.0—10

          循環(huán)中期          7.0—20

          黃體期            2.0--10

          絕經(jīng)后女性        20—100

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靈敏度:最小檢測卵泡刺激素濃度,1mIU/ml

 

 

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

 

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