黃體生成素（LH）ELISA試劑盒使用說明

 (德國DRG：EIA-1289)

1、 應(yīng)用范圍

DRG公司的LH酶聯(lián)免疫吸附試劑盒可用于血清中黃體生成素（LH）的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。

2、前言說明

在受到下丘腦釋放的黃體生成素釋放激素（LH-RH或者Gn-RH）的影響下，男性和女性的垂體前葉都可以產(chǎn)生LH（黃體生成素）。在男性中，LH也叫做促間質(zhì)細(xì)胞激素（ICSH），它是一種分子量大約為30000道爾頓的糖蛋白。它是由兩條不同的氨基酸鏈通過非共價鍵結(jié)合形成的復(fù)合物，一條α鏈，一條β鏈。α鏈與在人促甲狀腺激素（TSH）、卵泡刺激素（FSH）和人絨毛膜促性腺激素中找到的α鏈糖蛋白類似。這些激素的不同主要是由于他們β鏈的氨基酸組成不同所造成的，這也使它們產(chǎn)生了不同的免疫學(xué)功能。男性中LH的分泌是間歇性的，它的基本功能是刺激間質(zhì)細(xì)胞（萊迪希細(xì)胞）分泌睪酮。婦女體內(nèi)LH濃度的變化會受到正常月經(jīng)復(fù)雜排卵循環(huán)的影響，這也依賴于沿性腺-下丘腦-垂體軸的一系列激素活動。排卵前孕酮和雌二醇水平的降低啟動了每一個月經(jīng)周期。隨著激素水平的降低，下丘腦就增加促性腺激素釋放激素（GnRF）的分泌，它可依次刺激垂體增加FSH的生產(chǎn)和分泌。增加的FSH水平在卵泡階段可刺激一些卵泡的成熟，其中的一個卵泡就會成熟為含卵子的卵泡。隨著卵泡的發(fā)育，雌二醇就開始分泌，剛開始時很慢，但經(jīng)過12或13天的正常循環(huán)后它就開始迅速增加。因為垂體的直接刺激和增加的GnRF和FSH水平，雌二醇的就開始迅速增加，隨之LH就開始釋放了。而這些事件正好組成了排卵前期。在LH達(dá)到最高水平后，排卵作用大約會持續(xù)12到18個小時。排卵后就會形成可分泌孕酮和雌激素（這兩種激素是LH的兩個反饋調(diào)節(jié)物）的黃體。黃體期迅速的緊隨排卵期而來，黃體期明顯表現(xiàn)為高孕酮水平，雌二醇第二增加，低LH和FSH水平。低LH和FSH水平是沿下丘腦-垂體軸雌二醇和孕酮負(fù)反饋反應(yīng)的結(jié)果。受孕后，胚胎的發(fā)育可產(chǎn)生hCG，hCG使得黃體繼續(xù)產(chǎn)生孕酮和雌二醇。如果沒有受孕，黃體就會退化，相應(yīng)的孕酮和雌二醇水平就會降低，從而導(dǎo)致了月經(jīng)的形成。隨著這些激素低激素水平的形成，下丘腦就又再次開始一月經(jīng)周期患性腺機能退減的病人，其血清LH的濃度會增加。由于卵巢的發(fā)育不成熟、原發(fā)性的卵巢功能衰竭、多囊卵巢疾病或絕經(jīng)等原因，女性體內(nèi)類固醇激素的分泌會減少，而且在這些情況下，LH的分泌沒有受到調(diào)節(jié)。在男性中，但睪丸發(fā)育不正�；虼嬖跓o睪畸形時，也同樣會失去調(diào)節(jié)激素。在原發(fā)性睪丸衰竭和克氏綜合征患者中，盡管在雄性激素持續(xù)分泌的情況下LH濃度沒有必要提高，但我們也可發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在著高濃度的LH。在腎衰竭、肝硬化、甲狀腺功能亢進(jìn)和嚴(yán)重饑餓的情況下，LH的濃度也可出現(xiàn)提高。垂體前葉激素的分泌不足也可能導(dǎo)致低LH水平。正如人們所預(yù)測的，低LH水平可能導(dǎo)致男性和女性不育。雖然LH的低水平在垂體前葉對GnTH刺激反應(yīng)失效的情況下也會出現(xiàn)，但由于下丘腦GnRH分泌的降低，LH的水平就有可能降低。因此低LH水平可表明垂體或下丘腦存在功能障礙，但具體的問題根源必須通過其它實驗確定。在下丘腦、垂體或性腺功能障礙的鑒別診斷中，LH濃度的檢測常與FSH一起進(jìn)行檢測（以為兩者的功能緊密相連）。此外，激素的水平也可用來確定是否絕經(jīng)、計算排卵時間和監(jiān)測內(nèi)分泌治療效果。

3、實驗原理

   DRG公司的LH酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合LH分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性LH的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，該酶聯(lián)物是一種聯(lián)結(jié)有辣根過氧化物酶的抗LH抗血清。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。辣根過氧化物酶符合物的總量與樣本中LH的濃度成正相關(guān)。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中LH的濃度成正比。

4、試劑盒組成:

1)      微量反應(yīng)板，1塊 ( 96孔)，包被了抗LH的單克隆抗體。

2)      標(biāo)準(zhǔn)系列:6支，凍干，1ml，濃度: 0,10,20,40,100,200mIU/ml

3)      酶聯(lián)物，1支，11ml，辣根過氧酶標(biāo)記的抗LH抗血清，0.3%的Proclin作為防腐劑。 

4)      底物液，14ml (TMB)

5)      終止液:1支，0.5M H₂SO₄, 14ml，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。

5、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1）酶標(biāo)儀

2）精確移液器，25；50；100μl.

3）蒸餾水

4）吸水紙

5）計時器

6）半對數(shù)紙

6、儲存條件

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑，酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。如果包被板的包裝被打開，其免疫活性在6周內(nèi)穩(wěn)定，但前提是必須將它密封在裝有干燥劑的袋子里。

7、試劑準(zhǔn)備

實驗開始前，將所有試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。

標(biāo)準(zhǔn)品：在每支凍干粉的標(biāo)準(zhǔn)品中加入1.0ml蒸餾水重新配置標(biāo)準(zhǔn)品。注意：配制好的標(biāo)準(zhǔn)品在2-8℃的環(huán)境下可穩(wěn)定存放2個月，要想存放更長的時間則應(yīng)凍存于-20℃的環(huán)境下。

8、樣品

此實驗將用到血清，請不要使用易溶血、黃疸血和脂血樣品，注意：含疊氮鈉的樣品不可用于此實驗。

8.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝固，室溫離心分離血清。未完全凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人可能需要更長的凝血時間。

8.2樣品儲存

實驗開始前應(yīng)用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放48小時。如果將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下則可將其存放更長時間（只可凍融1次）。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。

8.3樣品的稀釋：

在第一次實驗中，樣本濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的樣品應(yīng)當(dāng)在實驗前用零緩沖液進(jìn)行稀釋。在計算濃度時，應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。例子：

a）按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零緩沖液（充分混合）。

b）按1：100稀釋：10ul稀釋好的a）+90μL的零緩沖液（充分混合）。

9、實驗步驟

所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都必須做雙份檢測以保證它們的檢測條件都一樣。每次檢測都必須有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1)      將所需數(shù)目的板條置于板架上。

2)      將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和血清樣本分別25μl加入到相應(yīng)的微孔中，每次都得使用新的取樣吸頭。

3)      加100μl的抗LH酶聯(lián)物于各孔中。

4)      混勻10秒,此步驟中完全混勻很重要。

5)      室溫溫育(22℃)30分鐘。

6)      棄去孔內(nèi)的反應(yīng)液。用蒸餾水洗板5次（每孔400ul），在吸水紙上把板拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確會明顯影響實驗的靈敏度和精密度。

7)      依原先加樣順序,每孔加100μl底物液。

8)      室溫(22℃)溫育10分鐘。

9)      按加底物液順序,每孔加50μl終止液于各孔中。

10)  加終止液后10分鐘內(nèi)在450nm波長讀吸光度。

10、結(jié)果計算

1)      計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)      用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值（mIU/ml）進(jìn)行標(biāo)繪，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)      用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4)      自動計算方法：說明書上的結(jié)果是用四參數(shù)計算得到的，其它的歸納方法可能會給出稍微不同的結(jié)果。

5)      樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中LH濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，任何稀釋了的樣品在計算時都必須將相應(yīng)的稀釋因子考慮進(jìn)去。

11、正常值

強烈建議每個實驗室都確定自己的正常值范圍和不正常值范圍。

用DRG公司的LH ELISA試劑盒對明顯健康人群進(jìn)行一研究，得到如下結(jié)果：