DRG瘦素ELISA試劑盒使用說明

(德國DRG: EIA-2395)

1、說明

DRG公司的瘦素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中瘦素的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。

2、實驗原理

   DRG公司的瘦素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合瘦素分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性瘦素的病人樣本在包被孔中與特異性兔抗瘦素抗體進(jìn)行孵育，之后就會形成一個夾心復(fù)合物。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的物質(zhì)，再加入過氧化物酶標(biāo)記的抗兔抗體以檢測結(jié)合在包被板上的瘦素的量。加入底物溶液后，顯出的顏色強度與病人樣品中瘦素的濃度成正比。

3、試劑盒成分

1)       包被板，12×8孔，可拆，微孔中包被了抗瘦素抗體（單克�。�

2)       標(biāo)準(zhǔn)品（0-5），6支 凍干型0.5mL，濃度：0,2,5,25,50,100ng/ml，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

3)       質(zhì)控品， 2支，200ul，即用，2個濃度（低與高），具體數(shù)值與范圍請見試劑瓶標(biāo)簽或QC質(zhì)控單。內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

4)       實驗緩沖液，1支，11ml，即用，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

5)       抗血清，1支，11ml，即用，單克隆瘦素抗血清，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑。

6)       酶復(fù)合物，1支，11ml ，即用，辣根過氧酶標(biāo)記的抗兔復(fù)合物，內(nèi)含0.3%的Proclin防腐劑

7)       TMB底物液，1支，14ml，即用

8)       終止液，1支，14ml，即用，內(nèi)含0.5M的H₂SO₄，避免接觸終止液，以免刺激皮膚或灼燒皮膚。

9)       洗滌液(40×)，1支 30ml

注：零標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)視需要而定。

4、實驗所需器材（但試劑盒不提供）

1)       酶標(biāo)儀 （450±10nm）（如DRG 公司的酶標(biāo)儀）

2)       精確取樣槍

3)       吸水紙。

4)       蒸餾水

5、貯存條件  

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存，在有效期內(nèi)可以保持活性。不要使用過期試劑。酶聯(lián)物、底物溶液、標(biāo)準(zhǔn)品和零標(biāo)準(zhǔn)品必須在2—8℃下貯存。

   微孔反應(yīng)板必須在2—8℃下貯存。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。

6、樣品采集

1）  血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。未完全凝血前請勿離心，接受了抗凝劑治療的病人樣品可能需要更長的凝血時間。

2）  血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。

3）  樣品的儲存：實驗開始前應(yīng)用蓋子將樣品密封好，2-8℃下可存放24個小時，如實驗之前需將樣品貯存更長的時間，應(yīng)當(dāng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下，并且只能凍存一次，不能反復(fù)凍存。解凍的樣本在實驗之前必須要上下倒置幾次。

7、樣品的稀釋：

在第一次實驗中，要是樣品的濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述用零標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋，并重新檢測。并且在計算濃度時需乘上此稀釋因子。

例子：

a）  按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）。

b）  按1：100釋�。�10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標(biāo)準(zhǔn)品（充分搖勻）

8、實驗步驟

所有的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有的檢測條件都一樣。每一次實驗都有一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。

2）用一次性吸嘴將標(biāo)準(zhǔn)品﹑質(zhì)控品和樣品分別15μL加入相應(yīng)的檢測孔中。

3）每孔加入100μL的檢測緩沖液。

4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。

5）室溫下溫育120分鐘。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。

7）每孔加入100μL抗血清。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

10）每孔加入100μL酶聯(lián)物。

11）在室溫下溫育30分鐘。

12）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔用300μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

13）每孔加入100μL底物液。

14）室溫溫育15分鐘。

15）每孔加入50μL終止液以終止酶反應(yīng)。

16）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。

9、結(jié)果計算

1)       計算每個標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)       用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4)       自動計算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動計算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。

5)       樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。

10、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。以下結(jié)果是以一定量正常人群的血液樣本為準(zhǔn)得出的實驗結(jié)果：

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。