關(guān)鍵詞：糞便DNA提取   糞便基因組提取   基因組DNA提取

北京艾德萊提供糞便基因組DNA快速提取采用硅膠膜技術(shù)從新鮮或冷凍人類糞便或其他樣品類型（混有高濃度的PCR抑制劑）中抽提多至30μg 的基因組、細(xì)菌、病毒和寄生物DNA。獨(dú)特的吸附樹脂配合經(jīng)優(yōu)化的緩沖液可去除PCR抑制劑。方便的Aidlab 離心柱純化過程只需40分鐘，用于從糞便中純化最多30μg 基因組、細(xì)菌、病毒和寄生蟲DNA；快速純化高品質(zhì)，即用型DNA；無有機(jī)提取或乙醇沉淀；持續(xù)的高產(chǎn)量；徹底去除污染物和下游反應(yīng)抑制物。純化的DNA長度可達(dá)50 kb。該長度的DNA變性完全，并具有最高的擴(kuò)增效率。高純度的DNA可直接用于下游擴(kuò)增反應(yīng)。原理，方法，操作一致。完美替代Qiagen公司QiaAmp DNA Stool Mini Kit。

 詳細(xì)介紹：

v         產(chǎn)品介紹：

常規(guī)的DNA純化方式并不能有效地去除糞便中存在的大量抑制因子而導(dǎo)致下游實(shí)驗(yàn)的失敗，如PCR不能擴(kuò)增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和新型獨(dú)特的溶液系統(tǒng)，能有效去除動(dòng)物糞便中各種影響下游實(shí)驗(yàn)（如PCR）的抑制因子，并能高效地回收糞便中的基因組DNA。動(dòng)物糞便樣品經(jīng)特殊緩沖液ASL重懸后，70℃處理5分鐘裂解細(xì)菌；離心去除不溶解的雜質(zhì)，蛋白酶K消化進(jìn)一步去除蛋白和雜質(zhì)；然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除， 最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

v         產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.          離心吸附柱內(nèi)硅基質(zhì)膜全部采用進(jìn)口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復(fù)性好�？朔�了國產(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端。

2.          不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

3.          快速，簡捷，單個(gè)樣品操作一般可在40分鐘內(nèi)完成。

4.          多次柱漂洗確保高純度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值達(dá)1.7～1.9，可直接用于PCR，Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。

v         注意事項(xiàng)

1.          所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。

2.          開始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃備用。

3.          結(jié)合液CB 和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.          洗脫液EB不含有螯合劑EDTA， 不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫， 但應(yīng)該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

5.          PCR可能被過量的DNA（一般大于1μg）抑制，使用最小用量的洗脫DNA（適當(dāng)稀釋）反而可以得到更好的擴(kuò)增。一般加入的洗脫DNA體積不要超過總PCR反應(yīng)體積的10％。我們建議在PCR反應(yīng)體系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有助于得到最佳擴(kuò)增效果。

v         操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請先閱讀注意事項(xiàng)）

提示：第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1.          收集約200-220mg糞便到一個(gè)2ml離心管，置冰上。

如果是冰凍的標(biāo)本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。

2.          加1.4ml 緩沖液ASL，連續(xù)渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一。

注意完全渦旋混勻，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。

3.          將重懸物70℃溫育5分鐘。

該加熱步驟可以提高3-5倍DNA產(chǎn)量，并且?guī)椭�裂解�?xì)菌和寄生蟲。對(duì)于某些難裂解的細(xì)胞（如革蘭氏陽性菌）可以提高到95℃。

4.          渦旋振蕩15秒，室溫放置1分鐘。最高速離心1分鐘沉淀糞便顆粒。

5.          轉(zhuǎn)移900μl上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入100μl雜質(zhì)清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鐘或者直到完全混勻均一，室溫放置1分鐘。最高速離心3分鐘去除雜質(zhì)。

6.          轉(zhuǎn)移所有上清到一個(gè)1.5ml離心管，最高速離心3分鐘。

7.          轉(zhuǎn)移210μl上清到一個(gè)1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，加入200μl 結(jié)合液CB，渦旋振蕩15秒，充分混勻。70℃溫育10分鐘。

如果產(chǎn)量偏低，可以轉(zhuǎn)移更多的上清，并且相應(yīng)的按比例提高蛋白酶K和結(jié)合液的和后面的異丙醇使用量。

8.          冷卻后加入100μl 異丙醇，渦旋混勻。

9.          將上一步所得溶液和可能出現(xiàn)的沉淀都加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。

10.       加入500μl抑制物去除液IR，12,000rpm 離心30秒，棄廢液。

11.       加入700μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

12.       加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。

13.       將吸附柱AC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

14.       取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100－150μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱）， 室溫放置2分鐘，12,000rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

15.       DNA可以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間存放，可以放置在－20℃。   

圖片說明：用Aidlab糞便基因組DNA提取糞便基因組DNA，然后用某腸道病原體引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。泳道M：100 bp DNA Ladder；泳道1-3：對(duì)腸道病原體檢測的PCR結(jié)果。