背景高

膜沒有完全均勻濕透

使用100% 甲醇浸透膜5-10min

洗膜不充分

增加洗液體積和洗滌次數(shù)

阻斷不充分

增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）

二抗?jié)舛冗^高

降低二抗?jié)舛?/DIV>

檢測過程中膜干燥

保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象

曝光過度

縮短曝光時(shí)間

抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)

檢測抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)

沒有陽性條帶，或者陽性條帶比較弱

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

酶失活

直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物

標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

設(shè)置陽性對照，如果陽性對照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考慮增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。

試劑不匹配

一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級檢測系統(tǒng)的有效性

一抗失效

選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

膜沒有完全均勻濕透

使用100%甲醇浸透膜

靶蛋白分子量小于10Kd

選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間

甲醇濃度過高

過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替

轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠

對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時(shí)間

抗體染色不充分

增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間

標(biāo)本中靶蛋白含量太低

增加標(biāo)本上樣量。

HRP抑制劑

所用溶液和容器中避免含有疊氮化鈉

抗體活性降低

選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置

封閉過度

減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型

曝光時(shí)間過短

延長曝光時(shí)間

條帶位置不對；或有非特異性條帶

色帶）

二抗的非特異性結(jié)合

增加一個(gè)對照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對重鏈的）

一抗的特異性不夠

使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性

蛋白降解

使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑

二聚體或多聚體存在

增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度

抗體濃度過高

降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶

蛋白上樣量過大

降低上樣量

封閉劑中有聚集體

使用前過濾封閉試劑

HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體

過濾二抗試劑，去除聚集體

HRP含量過高

降低酶聯(lián)二抗的濃度