相關(guān)背景資料main

        人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成開(kāi)啟了一個(gè)新的紀(jì)元——功能基因組時(shí)代來(lái)臨，與基因信息相比較，人們更關(guān)注于基因的功能、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與信號(hào)通路等信息。表觀遺傳學(xué)研究與核內(nèi)蛋白因子的功能分析成為基因表達(dá)調(diào)控研究的重要組成部分。結(jié)合了染色質(zhì)免疫共沉淀與基因芯片技術(shù)的ChIP-chip技術(shù)的浮現(xiàn)使得全基因組范圍內(nèi)DNA與蛋白相互作用的鑒定成為可能。

ChIP-Chip技術(shù)

ChIP-Chip技術(shù)應(yīng)用于反式作用因子研究

ChIP-Chip技術(shù)應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)

ChIP-Chip的芯片與算法


ChIP-Chip技術(shù)a1

        染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是基于體內(nèi)分析發(fā)展起來(lái)的方法，也稱結(jié)合位點(diǎn)分析法，在過(guò)去十年已經(jīng)成為表觀遺傳信息研究的主要方法。它的原理是在保持組蛋白和DNA聯(lián)合的同時(shí)，通過(guò)運(yùn)用對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定組蛋白標(biāo)記的生物抗體，染色質(zhì)被切成很小的片斷，并沉淀下來(lái)。這項(xiàng)技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會(huì)出現(xiàn)何種組蛋白修飾。ChIP不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。

      近年來(lái)，此技術(shù)不斷地發(fā)展，它與芯片技術(shù)相結(jié)合后，產(chǎn)生了染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation-chip, ChIP-chip）。免疫共沉淀結(jié)合微陣列技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)篩選蛋白結(jié)合靶點(diǎn)，成為深入分析癌癥、心血管疾病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具。

         ChIP-chip的基本原理是在生理狀態(tài)下把胞內(nèi)蛋白質(zhì)和DNA甲醛作用下交聯(lián)在一起，用超聲波打碎為0.2-2 kb的染色體小片段，然后通過(guò)目的蛋白質(zhì)特異性抗體沉淀此復(fù)合物，獲得特異地作用于目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片段的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。其中共沉淀的 DNA和合適的對(duì)照用熒光標(biāo)記，加在載玻片上，用于芯片分析。使用外源性DNA作為背景，免疫沉淀DNA與作為背景的對(duì)照進(jìn)行比較，可以找到特異性蛋白在基因組中的結(jié)合位點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，ChIP-chip分3步完成：ChIP，DNA處理，芯片分析，如圖1所示。采用ChIP－chip方法，Ren等人利用酵母基因間DNA芯片檢出酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4 和Set 12 的新靶點(diǎn)。

ChIP-Chip技術(shù)應(yīng)用于反式作用因子研究a2

        ChIP-chip，又被稱為CHIP on chip，能鑒定組蛋白修飾的特異性序列，確定核蛋白結(jié)合靶點(diǎn)，主要應(yīng)用于兩方面：第一，確定轉(zhuǎn)錄因子及其作用位點(diǎn)；第二應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究。ChIP－chip直接與蛋白結(jié)合的基因作為靶點(diǎn)，而傳統(tǒng)的芯片無(wú)法區(qū)分直接調(diào)控基因和間接調(diào)控基因。 由ChIP-chip直接在體內(nèi)獲得的全基因組數(shù)據(jù)，可以直接用于生物信息學(xué)分析，更直接的識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。

        ChIP與基因芯片相結(jié)合建立的ChIP-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)；RNA-CHIP用于研究RNA在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。它與DNA芯片和分子克隆技術(shù)相結(jié)合，可用于高通量的篩選已知蛋白質(zhì)分析的未知DNA靶點(diǎn)和研究反式作用因子在整個(gè)基因組上的分布情況。

        ChIP-chip技術(shù)對(duì)于大規(guī)模挖掘順式調(diào)控信息成績(jī)卓著，同時(shí)它可以用于胚胎干細(xì)胞和一些疾病如癌癥、心血管疾病和中央神經(jīng)紊亂的發(fā)生機(jī)制的研究。

ChIP-Chip技術(shù)應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)(epigenetics)a3
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        在基因組中除了DNA和RNA序列以外，還有許多調(diào)控基因的信息，它們雖然本身不改變基因的序列，但是可以通過(guò)基因修飾，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、DNA和其它分子的相互作用，而影響和調(diào)節(jié)遺傳的基因的功能和特性，并且通過(guò)細(xì)胞分裂和增殖周期影響遺傳的一門(mén)新興學(xué)科。因此表觀遺傳學(xué)又稱為實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)、特異性遺傳學(xué)、后遺傳學(xué)、表遺傳學(xué)和基因外調(diào)節(jié)系統(tǒng)，它是生命科學(xué)中一個(gè)普遍而又十分重要的新的研究領(lǐng)域�？傊�，表觀遺傳學(xué)就是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化,如DNA甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等，而表觀基因組學(xué)(epigenomics)則是在基因組水平上對(duì)表觀遺傳學(xué)改變的研究。目前，表觀遺傳學(xué)的各方面數(shù)據(jù)已經(jīng)成為細(xì)胞狀態(tài)的基本標(biāo)志。

        表觀遺傳學(xué)主要內(nèi)容包括甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)改型。ＤＮＡ的甲基化是生物關(guān)閉基因表達(dá)的一種有效手段，也是印跡遺傳的主要機(jī)制之一。ChIP-chip技術(shù)可以提供有關(guān)人的基因編碼區(qū)中組蛋白甲基化分布模式的信息。CpG島甲基化是基因組甲基化的一個(gè)重要指標(biāo)，目前認(rèn)為CpG島甲基化導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制是惡性腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一。為了同時(shí)研究基因表達(dá)，DNA甲基化和組蛋白乙�；�，出現(xiàn)了一種從CpG島中設(shè)計(jì)發(fā)展而來(lái)的芯片，CpG島表達(dá)序列標(biāo)簽芯片。采用CpG島芯片，就可以顯示基因組內(nèi)CpG甲基化和組蛋白修飾之間的聯(lián)系。

        ChIP-chip技術(shù)鑒定表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)信息已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。在干細(xì)胞iPS技術(shù)中，表觀遺傳學(xué)到研究至關(guān)重要，是確定iPS細(xì)胞是否具有干細(xì)胞特征的基本手段。2007年，日本京都大學(xué)的Shinya Yamanaka領(lǐng)導(dǎo)的研究小組通過(guò)iPS獲得人類(lèi)干細(xì)胞后，正是運(yùn)用了ChIP-chip技術(shù)對(duì)這些誘導(dǎo)得到的干細(xì)胞進(jìn)行甲基化等表觀遺傳信息進(jìn)行分析。

ChIP-Chip的芯片與算法a4a4

       和許多基因芯片相關(guān)的技術(shù)一樣，數(shù)據(jù)處理是一個(gè)難點(diǎn)。ChIP-chip獲得大量的復(fù)雜的數(shù)據(jù)，如何從中聚類(lèi)、挖掘、分析，得到有效的數(shù)據(jù)及信息是這種方法的關(guān)鍵步驟之一。

        目前，ChIP-chip分析中最常用Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的ChIP-chip嵌合芯片（Affymetrix tiling arrays）。Tiling芯片是迄今為止分辨率最高的基因芯片類(lèi)型，它的探針設(shè)計(jì)幾乎涵蓋了目標(biāo)DNA的全部序列。目前為止，Affymetrix公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了人、小鼠、酵母、線蟲(chóng)、擬南芥等模式生物的全基因組Tiling芯片，為全基因組規(guī)模上研究目的蛋白與核酸的相互作用提供了強(qiáng)有力的分析工具。除了全基因組芯片外，還包括了專(zhuān)門(mén)應(yīng)用于ChIP-chip技術(shù)中的人啟動(dòng)子和小鼠啟動(dòng)子兩款芯片，探針設(shè)計(jì)覆蓋了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近10kb的范圍，針對(duì)腫瘤相關(guān)的1300個(gè)基因中，覆蓋范圍更增加到12.5kb。Affymetrix開(kāi)發(fā)了相應(yīng)算法，運(yùn)用隱馬爾可夫模型，從ChIP-chip技術(shù)獲得事基因組數(shù)據(jù)中抽取大量轉(zhuǎn)錄因子信息。

        兩步模型法（2-step paradigm）是最常用于分析ChIP-chip數(shù)據(jù)的方法。首在獲得的數(shù)據(jù)中在結(jié)合部位抽取500-1000bp左右的序列信息。然后在這些序列中進(jìn)行模式比對(duì)，可以獲得粗糙的目的數(shù)據(jù)集，進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘和分析。為了簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理與及得到更為敏感有效的數(shù)據(jù)，科學(xué)家正努力不懈地完善算法。最近， Heejung Shim 和Sündüz Kele 發(fā)表了CTCM模型（conditional two-component mixture (CTCM) model），聲稱已經(jīng)通過(guò)測(cè)試，可以一步法獲得高專(zhuān)一性、高敏感度的有效ChIP-chip數(shù)據(jù)，尤其對(duì)一些低豐度的數(shù)據(jù)效果顯著。