用前取一瓶溶解，每200 ml培養(yǎng)液加滅活的小牛血清至終濃度為10%，即加22ml。再加青霉素和鏈霉素至終濃度各為100 U/ml。

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細(xì)胞培養(yǎng)液

熱滅活：56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清

熱滅活目的：滅活血清中的補體成分。如果不做細(xì)胞因子和免疫相關(guān)的實驗，建議血清不要滅活。因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，還會影響血清的質(zhì)量。滅活后嚴(yán)重影響細(xì)胞生長速度，且細(xì)胞貼壁率降低。

 

— 絮狀物：血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質(zhì)量�？捎秒x心3000 rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理

— 顯微鏡下“小黑點”：經(jīng)過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細(xì)胞生長，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號的血清

       組織細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體，可以維持滲透壓、調(diào)節(jié)pH值、供給細(xì)胞生存所需的能量和無機離子成分，用于洗滌組織、細(xì)胞等

    KCl                       0.20g             KH₂PO₄                 0.20g

      NaCl                     8.00g             Na₂HPO₄•7H₂O      2.16g

DPBS（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Sallines）標(biāo)準(zhǔn)型

CaCl₂(無水氯化鈣)       0.10g      KCl                     0.20g

KH₂PO₄                 0.20g             MgC_l2·6H2O        0.10g

NaCl                    8.00g             Na₂HPO₄·7H₂O      2.16g

KCl                0.40g      KH₂PO₄          0.06g

NaCl              8.00g      NaCO3        0.35g

Na2HPO4       0.048g    D-Glucose      1.00g      Phenol Red     0.01g

消化液：分離組織和分散細(xì)胞

—    常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉(EDTA)兩種溶液

—    單獨或混合使用

—    主要作用：使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，使細(xì)胞相互離散

—    消化細(xì)胞時，加入一些血清或含血清的培養(yǎng)液，能終止消化作用

       —    胰蛋白酶溶液配制

              1、稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，用少許D-Hanks 平衡鹽溶液調(diào)成糊狀，再補足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時或冰箱過夜，不斷攪拌振蕩

              2、次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中， -20℃保存?zhèn)溆茫ㄒ悦夥纸馐�效），常用濃度�?.25% （0.1%-0.5%）

              3、胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右

       —    一種化學(xué)螯合劑，對細(xì)胞有一定的離散作用，毒性小，價格低廉，使用方便

       —    常用工作液濃度為0.02%。

               注意：使用EDTA 處理細(xì)胞后，要用平衡鹽液沖洗干凈，因殘留的EDTA 會影響細(xì)胞生長

       —    EDTA 溶液配制：用D-Hanks’ 平衡鹽溶液溶解后，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，4℃冰箱保存

       —    NaHCO3 溶液

               常用濃度為7.5%。配制時用三蒸水溶解后，過濾除菌或高壓滅菌，分裝，4℃保存

       —    HEPES（分子量238.31）溶液

              1、一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性

              2、主要作用：防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO2的環(huán)境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES

              3、使用終濃度一般為10-50mmol/L

              4、常配成1M 儲存液：用20ml 雙蒸水溶解4.76克HEPES，過濾除菌或高壓滅菌，分裝小瓶，4℃保存。使用時可向100ml培養(yǎng)液中加入2ml HEPES濃縮液，終濃度為20mmol/L

       —    谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加

       —    配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)，使用終濃度為1-4 mmol/L。

       —    一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200 mmol/L（29.22 g/L）

       —    配制方法為 ：

              谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100ml即配成200 mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅☉?yīng)加溫30℃），過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100 ml 培養(yǎng)液中加入0.5-2 ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1-4 mmol/L

       —    大多數(shù)培養(yǎng)液中使用酚紅作為pH 指示：

              紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示堿性pH；

       —    在一些特殊培養(yǎng)液中不含酚紅：

              因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用

       —    抗生素使用種類與濃度：

                     抗生素                    工作濃度      儲存溫度    殺滅細(xì)菌

              penicillin(青霉素)            100 u/ml      -20℃        G(+)

              streptomycin(鏈霉素)           100 ug/ml     -20℃     G(+) 、G(-)

              gentamicin(慶大霉素)       50 ug/ml      -20℃   G(+)、G(-)、支原體

              amphotericin B(潮霉素B)     2.5 ug/ml     -20℃        真菌

              nystatin(制霉菌素)          50 ug/ml      -20℃        真菌

       —    冷凍保存要點：

              1、冷凍過程要緩慢

                     4℃ 30－60 分鐘

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                     -20℃ 30 分鐘

　　　                  ↓

                     -80℃ 16－18 小時（或過夜）

                            ↓

                     液氮長期保存

              2、凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。

              3、細(xì)胞濃度控制在：1×107－5×107/ml。

       —    常用細(xì)胞冷凍保存液

              10％DMSO ＋ 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

              10％甘油＋ 完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液（20％血清＋基礎(chǔ)培養(yǎng)液）

 

       —    快速解凍

              1   凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）；

              2     解凍后的細(xì)胞可直接接種到含完全生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進行培養(yǎng)，24 小時后再用新鮮完全培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO；

              3     如果細(xì)胞對冷凍保護劑特別敏感，解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到含完全生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中

       —    解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法

              1   從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍；

              2   將1－2ml 凍存細(xì)胞液加入到25ml 新鮮完全細(xì)胞生長培養(yǎng)液中，輕輕混勻

              3     用80g 離心2－3 分鐘，棄上清液

              4     用完全生長培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團，并計數(shù)細(xì)胞

              5     接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度為3×105/ml。