保存菌種或長(zhǎng)時(shí)間放置的培養(yǎng)板應(yīng)先劃板活化菌種，挑取分隔良好的單 克隆接種于2-10 ml ＬＢ中（如菌種含質(zhì)粒則應(yīng)加抗生素）３７攝氏度快搖 ８小時(shí)，按0.1%-0.5% 比例轉(zhuǎn)種，培養(yǎng)基的量不應(yīng)超過錐瓶的0.25容量，以 保證足夠的通氣。用O.D.600 測(cè)菌密度時(shí)，讀數(shù)值在0.1-0.5 范圍內(nèi)為線性相關(guān)，超過該范圍的應(yīng)作稀釋。通常１升的過夜培養(yǎng)12-16h，濕重為3 g左右，密度往往是3-4 ′109 個(gè)細(xì)胞／每毫升培養(yǎng)物離心收菌后可在-20攝氏度凍存數(shù)周。

A．過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種后27拚２度快搖約205hrs至O.D 值為0.3 左右。

B．�。眒l菌液離心收菌，加入0.1ml 冰浴的1 ′TSS 液輕輕吸打懸起細(xì)胞。（可以放-70 攝氏度凍存半年）B 、可以取0.1ml 菌液加入0.1ml 冰浴的2 ′TSS 混勻，該方法只適于做質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，如做連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化請(qǐng)按２Ａ做。

C．加100pg-10ngDNA 混勻。冰浴10min ，室溫放置10分鐘再次冰浴10mins.

D．加1ml LB，37攝氏度1 小時(shí)。

E．涂板。轉(zhuǎn)化效率106-108 對(duì)于DH52，Ｃ600 ，等轉(zhuǎn)化效率在107-108 以上）。 快速鑒定插入外源片段的克隆

由于載體自身環(huán)化會(huì)產(chǎn)生大量的不含插入片段的轉(zhuǎn)化子，給鑒定重組子帶來一些麻煩。通常用雙酶切（即插入片段兩端酶切位點(diǎn)不同）載體去磷酸化，或者藍(lán)白斑篩選有助于減少這種麻煩，但有的時(shí)候還是會(huì)需要大量篩選轉(zhuǎn)化子中的重組子。

A．Epicertre 公司提供一種快速連接和篩選試劑盒�？稍谵D(zhuǎn)化子分布不是太密時(shí)（較低的鋪板密度）待菌長(zhǎng)到較大時(shí)，用滅菌牙簽沾很少量菌點(diǎn)板（轉(zhuǎn)到新的篩選平板上以便給菌落編號(hào)），將剩下的菌全部挑起轉(zhuǎn)至已加入快速篩選試劑的epperdorf管中，混句，補(bǔ)加試劑2 后即可準(zhǔn)備上樣跑電泳，鑒定是否插入外源片段。

B．轉(zhuǎn)化子密度很高時(shí)可用滅菌牙薟沾取菌落，點(diǎn)板編號(hào)后插入含1mlLB （含抗生素）的小試管中，加蓋，37攝氏度快搖3-5hrs至LB渾濁（肉眼觀察很明顯長(zhǎng)菌），轉(zhuǎn)至epperdorf 管中離心收菌，去上清。加入15ml含RNAse A 和溴酚藍(lán)（溴酚藍(lán)也可以最后上樣再加）的ＴＥ，振蕩以充分懸浮細(xì)胞，加入15ml酚一氯仿劇烈振蕩5-10秒，離心，取上清即可上樣電泳。注意這時(shí)電泳槽中buffer的量應(yīng)比膠面高2mm ，上樣時(shí)要小心，避免上清的擴(kuò)散。膠不宜太厚。如果細(xì)菌太多加酚后振蕩應(yīng)為液狀，如成固體狀就是太多菌了）則要相應(yīng)增加ＴＥ和酚氯仿量。另外，我們推薦CＬＰ公司或Ａ、Ｂ公司的電泳槽，這種電泳槽的承膠底座是透紫外的，當(dāng)制膠時(shí)加入ＥＢ即可在電泳的過程中觀察電泳情況。在大量篩選時(shí)往往要同時(shí)跑很多的樣品，制較大的膠，在ＤＮＡ量較少的情況下往往需用短波下紫外觀察以便得到更清楚的結(jié)果。用這種電泳板即可直接把承膠底座連膠一起放在下紫外燈上（或凝膠成像系統(tǒng)中），不需要將膠推下來或倒置。在需要時(shí)即可繼續(xù)電泳。

A．用含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)菌會(huì)有較高的得率。

B．收菌時(shí)用tips吸干凈殘余的培養(yǎng)基上清。

C．加入Ｐ１后應(yīng)充分振蕩以完全打散懸浮細(xì)胞，特別是多次離心收菌的情況下較難打散細(xì)菌，可用tips 反復(fù)吸打因?yàn)闅埩舻男�塊菌團(tuán)會(huì)嚴(yán)重影響得率和DNA 的質(zhì)量。

D．加入Ｐ２后立即輕輕搖勻，可反復(fù)倒轉(zhuǎn)epperdorf 管4-6 次充分混勻菌數(shù)較多時(shí)可靜置不超過5 分鐘，以便充分裂解提高得率，超過5 分鐘的會(huì)降低質(zhì)粒質(zhì)量。甚至可能出現(xiàn)部分質(zhì)粒不可逆的變性的情況，可能在電泳時(shí)得到一條酶切不動(dòng)的質(zhì)粒條帶。

E．加入Ｎ３后立即輕輕混勻，可反復(fù)倒轉(zhuǎn)epperdorf 管5-7 次以充分混勻。菌數(shù)較多時(shí)可靜置幾分鐘以便質(zhì)粒充分復(fù)性。

F．離心后上清液上柱，注意不要將懸浮的細(xì)胞碎片（如果有的話）加入柱中，如已在柱中請(qǐng)吸出。我們建議一定用PB洗柱，特別是菌數(shù)較多，或菌株糖蛋白較多的情況，以保證DNA 的質(zhì)量。

G．對(duì)于較大的質(zhì)粒，（<10Kb ），請(qǐng)70攝氏度預(yù)熱、洗脫buffer或ddH2O 以提高得率，對(duì)于拷貝數(shù)不高的情況可以用50ml洗脫buffer或ddH2O 分別洗2 次，如果拷貝數(shù)高的可用100ml.靜置1 分鐘后再離心，有助提高得率，buffer或H2O 應(yīng)加在膜中央而非管壁上。

在構(gòu)建融含蛋白表達(dá)載體時(shí)除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會(huì)減少一些不必要的麻煩，當(dāng)外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個(gè)基因的前面時(shí)，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase 補(bǔ)齊，去粘末端等技術(shù)調(diào)整讀碼框時(shí)或不同酶切位點(diǎn)粘端連接時(shí)要注意。如XbaI識(shí)別序列隱含終止密碼，調(diào)整碼框時(shí)就要注意，又如BamH I酶切粘端為GATCC ＿補(bǔ)平后如果接到T 后面就有可能形成TGATCC這種隱含終止密碼的情況。（還有外源基因本身不可帶終止密碼）另外要注意啟動(dòng)子后面避免出現(xiàn)幾個(gè)靠近的不同框架的ATG ，以減少對(duì)表達(dá)的影響。如果插入片段插到載體終止密碼前和另一個(gè)基因后面，則只用注意插入片段前方是否有終止密碼即可。

A．找不到適合的酶切位點(diǎn)。由于各廠家不定期的推出新的限制性內(nèi)切酶品種，這些酶切識(shí)別序列可能尚未在有關(guān)Catalog 上出現(xiàn)，用現(xiàn)有的軟件也查不到這些酶切點(diǎn)，如New England Biolabs 公司前一段時(shí)間剛推出了20多種新的內(nèi)切酶。請(qǐng)隨時(shí)向各廠家或供應(yīng)商查詢，并記得將新的品種加入到您的記錄中以便查閱，這些新的內(nèi)切酶有可能正是您要找的呢。

B．在文獻(xiàn)上找到的內(nèi)切酶在廠家目錄上找不到。由于來源不同，許多識(shí)別序列，酶切點(diǎn)完全本同的酶會(huì)有不同的名字，各供應(yīng)商目錄往往會(huì)有相應(yīng)的附錄以供用戶查詢，比如在New England Biolabs 的Catalog 后面20項(xiàng)或基因有限公司2000Catalag前面都附有相當(dāng)完整的內(nèi)切酶列表（含1999年以前絕大部分商品化的酶），從左邊一欄尋找你已知的酶的名字，找到后可以查出相應(yīng)的識(shí)別序列，各種同功酶的名稱，
酶在NEB 廠家所用的名稱和目錄號(hào)等。另外也可以通過已知酶的識(shí)別序列在相應(yīng)的表中找到相應(yīng)的酶名稱。當(dāng)然這些表可能不含最新發(fā)現(xiàn)的酶。

C．Dam Den 甲基化對(duì)酶切點(diǎn)的影響。有時(shí)用試劑盒純化的質(zhì)粒用別的酶都切得動(dòng)，用Bcl I ，等酶就是切不動(dòng)。原因在于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的Ecoli 菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個(gè)甲基化敏感的酶。當(dāng)其識(shí)別序列被甲基化后BclI就出現(xiàn)切不動(dòng)的情況。而Bam HI則對(duì)甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當(dāng)你要用BclI這類切點(diǎn)時(shí)，請(qǐng)選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內(nèi)切酶對(duì)甲基化敏感與否取決于其識(shí)別序列兩端的堿基，詳細(xì)資料請(qǐng)參考廠家目錄的有關(guān)附錄，如NEB 目錄268 、269 頁。

D．同進(jìn)進(jìn)行雙酶切要注意：

①任何時(shí)候2 種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的0.1②雙酶切時(shí)如果兩種酶反應(yīng)溫度一致而buffer不同時(shí)，可查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（NEB 目錄251 ）頁，如果有一種buffer能2 使種酶的活力都超過70% 的話，即可用這種buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可各取一半中和。

③如果2 個(gè)酶buffer成份相差較大或2 個(gè)酶的反應(yīng)溫度不同則必需分別做酶切。廠家目錄一般都會(huì)有相應(yīng)的附錄以供查詢各種酶的反應(yīng)溫度。

④第一個(gè)酶切后可以電泳確證酶切完全后從膠中回收DNA 再進(jìn)行下次酶切也可以在第一個(gè)酶切后用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit純化酶切樣，保留少量做電泳分析之用后再進(jìn)行下一次酶切。還有一種屯化管（eppendorf 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被甩掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入ddH2O 離心洗滌后加幾微升在膜上，將柱子反轉(zhuǎn)插入新的epperdorf 管上離心即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

⑤特別注意，雙酶切載體時(shí)如果2 個(gè)酶切位點(diǎn)靠得很近，必須注意酶切順序，因?yàn)椴煌�的�?nèi)切酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)兩端堿基數(shù)目要求不同，有的酶要求識(shí)別序列兩端有多個(gè)堿基的必須先切，比如LITMUS29中先切BamHI 再切Hind 時(shí)就會(huì)出現(xiàn)切不動(dòng)的情況。更詳細(xì)的數(shù)據(jù)可參考相應(yīng)的附錄，如NEB 公司目錄的259 頁。

E．設(shè)計(jì)合成引物時(shí)加入酶切點(diǎn)往往為后繼的實(shí)驗(yàn)帶來很多方便，比如PRC 產(chǎn)物經(jīng)酶切后可以定向克隆到載體中，但在設(shè)計(jì)時(shí)需注意不同的限制性內(nèi)切酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)兩端的堿基數(shù)目要求不同。例如HindⅡCla Ⅰ，要求其識(shí)別序列5 端至少有多個(gè)堿基，這個(gè)酶才能切動(dòng)，有的內(nèi)切酶在兩端堿基不同時(shí)切割效率也不同，設(shè)計(jì)引物時(shí)要特別注意。有關(guān)數(shù)據(jù)可查詢各供應(yīng)商附錄表，如NEB 公司第258-259 頁。

F．小量酶切時(shí)用較小的管化1.5 的管好，可以減少因?yàn)檎舭l(fā)造成的體積減少，濃度改變。

可以用來驗(yàn)證是否補(bǔ)齊連接成功，例如Bam HI酶切補(bǔ)齊再連接后產(chǎn)生的序列可以被cla Ⅰ，ＤpnⅡ，Taq Ⅰ所切動(dòng)。詳細(xì)資料可查詢供應(yīng)商的附錄，如２６４－２６５8 、 有些酶的識(shí)別位點(diǎn)不同但產(chǎn)生的粘端是匹配的，可以直接連接Ⅱ，如Bcl I ，Bam HI和Ｂgl Ⅱ，酶切產(chǎn)生的粘端就是匹配的，可以直接連接。詳細(xì)資料可參考供應(yīng)商的附錄如NEB 目錄的２６６－２６７9 、 各供應(yīng)商送貨時(shí)往往會(huì)提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或?qū)�幾個(gè)小冰袋（化凍后）填料塞入一個(gè)小泡沫盒中壓實(shí)，再插入各種大小的廢管，放在-20 攝氏度凍24小時(shí)后了取出，拔出插入的廢管（可加點(diǎn)熱水以助拔管）即可做成一個(gè)科易冰盒，可在室溫下保持6-24小時(shí)的低溫呢（平時(shí)要在-20 攝氏度放置）在制冰機(jī)有問題或停電時(shí)就不用怕了。 10、用CLP 的10ml/200ml 兩用tips盒，這種盒的芯可調(diào)的，可以放10ml的小tips ，也可調(diào)整為放２００ml tip的盒，根據(jù)需要隨時(shí)轉(zhuǎn)換非常方便。

A．任何時(shí)候2 種酶的總量不能超過反應(yīng)體系的1/10體積。

B．雙酶切時(shí)如果兩種酶反應(yīng)溫度一致而buffer不同時(shí)，可查閱內(nèi)切酶供應(yīng)商在目錄后的附錄中提供的各種酶在不同buffer中的活力表（也可以向ebiotrade.com客戶服務(wù)部索取），如果有一種buffer能同時(shí)使2 種酶的活力都超過70% 的話，就可以用這種buffer作為反應(yīng)buffer. 如果兩種酶廠家不同無法查時(shí)可比較其buffer成份，相似的話可以考慮各取一半中和。

C．如果2 種酶的buffer成份相差較大或2 種酶的反應(yīng)溫度不同則必須分別做酶切。第1 種酶切后要考慮用酚抽、電泳或加熱等方法使酶失活后再進(jìn)行下一次酶切反應(yīng)。廠家目錄一般都會(huì)有相應(yīng)的附錄以供查閱各種酶的反應(yīng)溫度。有的酶可以用加熱使之失活，有的則不行，這些信息也可以在有關(guān)附錄中查詢，也可以向ebiotrade.com客戶服務(wù)部索取。

D． 第一次酶切后通過電泳確證酶切完全后可以從膠中回收DNA 片段再進(jìn)行下次酶切，也可以在第一個(gè)酶切后直接用PCR 產(chǎn)物回收試劑盒或Nucleotide Removal Kit 純化酶切樣（只需5 分鐘），保留少量樣品做電泳分析之用，再進(jìn)行下一次酶切。還可以用一種離心純化管或叫做離心濃縮管（Eppendorf ，S&S 等廠家有售），將酶切樣加入后離心，鹽等成份被過濾掉而核酸則被截留在柱子中間的膜上，加入適量ddH2O ，離心以洗去膜上殘留的雜質(zhì)，再加幾微升ddH2O 在膜上，將柱子反轉(zhuǎn)插入新的eppendorf 管上，離心，即可將DNA 片段離下來，做下一次酶切。

E．特別注意：在雙酶切載體時(shí)如果2 個(gè)酶切位點(diǎn)靠得很近，必須注意酶切順序。因?yàn)橛械南拗菩詢?nèi)切酶要求其識(shí)別序列的兩端至少保留有若干個(gè)堿基才能保證酶的有效切割。有的酶要求識(shí)別序列兩端有多個(gè)堿基的，則必須先切，否則就可能造成酶切失敗。比如質(zhì)粒pLITMUS29 的多克隆位點(diǎn)中BamH I旁邊有HindIII 位點(diǎn)，如果先切BamH I再切HindIII 時(shí)就會(huì)出現(xiàn)HindIII 切不動(dòng)的情況，但是反過來就沒問題。更詳細(xì)的數(shù)據(jù)可參考相應(yīng)的附錄，也可以向ebiotrade.com 客戶服務(wù)部索取。

9． Dam Dcm 甲基化對(duì)酶切的影響。

有時(shí)質(zhì)粒用別的酶都切得動(dòng)，用Bcl I 、Cla I 等酶就是切不動(dòng)。原因可能在于多數(shù)實(shí)驗(yàn)室常用的E.coli菌株都有甲基化的功能，而BclI是一個(gè)對(duì)甲基化敏感的酶。當(dāng)其識(shí)別序列被甲基化后BclI就出現(xiàn)切不動(dòng)的情況。而BamH I則對(duì)甲基化不敏感，所以甲基化與否都照切不誤。當(dāng)你要用BclI這類切點(diǎn)時(shí)，請(qǐng)選用甲基化缺陷的Ecoli 菌株如GM119 或其他菌種。有的內(nèi)切酶對(duì)甲基化敏感與否取決于其識(shí)別序列兩端的堿基，例如Cla I ，3 ‘端相連的堿基為C 時(shí)就會(huì)對(duì)甲基化敏感。這樣的酶有好幾種，詳細(xì)資料請(qǐng)參考廠家目錄的有關(guān)附錄，或向ebiotrade.com 客戶服務(wù)部索取。

1 、 各供應(yīng)商送貨時(shí)往往會(huì)提供冰袋，在室溫下將化凍的大冰袋平整的一面整齊地插入1.5ml 或0.5ml 、0.2ml 的廢棄離心管；或?qū)�幾個(gè)化凍后的小冰袋填料塞入一個(gè)小泡沫盒中壓實(shí)，再插入各種大小的試管，放在-20 攝氏度下凍24小時(shí)后取出，拔出插入的廢管（可加點(diǎn)熱水以助拔管）即可做成一個(gè)簡(jiǎn)易冰盒，可在室溫下保持6-24小時(shí)的低溫呢（不用時(shí)要放在-20 攝氏度下存放）。在制冰機(jī)有問題或臨時(shí)停電時(shí)就不用怕了。

2 、有一種10μl/200 μl 兩用tips盒，這種盒的芯可調(diào)的，可以放10μl 的小tips ，也可調(diào)整為放200 μl 的tips，根據(jù)需要隨時(shí)轉(zhuǎn)換，非常方便。