DNA酶切問題集錦
我們在進行分子生物學實驗，常需要對DNA片段進行酶切。在此，我們對酶切實驗中遇到的一些問題做了相應歸納。
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帶型 |
原因 |
結果分析 |
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DNA完全沒有被內切酶切割 |
內切酶失活 |
標準底物檢測酶活性 |
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DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內切酶抑制因子 |
將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA | |
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條件不適（試劑、溫度） |
檢查反應系統(tǒng)是否最佳 | |
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DNA酶切位點上的堿基被甲基化 |
換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質粒DNA轉化至dcm-，dam-基因型的細菌菌株 | |
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DNA酶切位點上沒有甲基化（如Dpn I） |
換用不同切割非甲基化位點的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質粒轉至dcm+ dam+菌株中擴增 | |
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DNA位點上存在其它修飾 |
將DNA底物與λDAN混勻進行切割驗證 | |
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DNA不存在該酶識別順序 |
換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進行驗證 | |
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DNA切割不完全 |
內切酶活性下降 |
用5-10倍量過量消化 |
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內切酶稀釋不正確 |
用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 | |
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DNA不純，反應條件不佳 |
用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 | |
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內切酶識別的DNA位點上的堿基被甲基化或存在其它修飾 |
用酶貯藏液或反應緩沖液稀釋酶 | |
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部分DNA溶液粘在管壁上 |
反應前離心數秒 | |
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內切酶溶液粘度大，取樣不準 |
將內切酶稀釋，增大取樣體積 | |
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酶切后DNA粘末端退火 |
電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷 | |
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由于反應溶液、溫度、強烈振蕩使內切酶變性 |
使用標準反應緩沖液及溫度，避免強烈振蕩 | |
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過度稀釋使酶活性降低 |
適當稀釋酶液，反應液稀釋的酶不能貯藏 | |
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反應條件不適 |
使用最佳反應體系 | |
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識別位點兩側插入了可影響酶切效率的核酸順序 |
加大酶量5-10倍 | |
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DNA片段數目多于理倫值 |
內切酶星狀活 |
檢查反應條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導致星狀活性，降低酶的用量 |
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其它內切酶污染 |
用λDNA作底物檢查酶切結果 | |
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底物中含其它DNA雜質 |
電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段 | |
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酶切后沒有觀察到DNA片段存在 |
DNA定量錯誤（如RNA含量較高） |
用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量 |
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在酶切反應液中形成非特異的沉淀 |
在反應前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次 | |
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內切酶保存期內快速失活 |
保存溫度不合適 |
內切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應在-20℃低溫保存 |
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以稀釋形式保存 |
稀釋酶液不宜長期存放，應一次使用 | |
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貯藏緩沖液不適當 |
使用廠家推薦的貯藏緩沖液 | |
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低蛋白濃度 |
內切酶與500ug/ml的BSA一起保存 | |
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電泳DNA片段帶型彌散不均 |
DNA上結合有蛋白質 |
電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提純化 |
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內切酶中含有DNA外切酶 |
減少酶用量或消化時間，換用新包裝的酶 | |
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酶切后的DNA片段連接效率低 |
含磷酸鹽的濃度高 |
透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽 |
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內切酶失活不全或含有ATP酶 |
延長滅活時間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA | |
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平末端連接 |
加大T4 DNA Ligase用量 | |
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外切酶污染 |
減少酶用量，縮短保溫時間，酚抽提回收DNA | |
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連接緩沖液不合適 |
重新配制連接緩沖液 |
標簽：
DNA酶切問題
